ชุด RT-qPCR โดยตรง III
คำอธิบาย
ชุด RT-qPCR โดยตรงให้บัฟเฟอร์ RT-qPCR ที่บรรจุแยกต่างหาก (โดยผสม Foreasy HS Taq DNA polymerase) และมีประสิทธิภาพสูงForeasy Reverse Transcriptase (MMLV),ทำให้สะดวกสำหรับการสร้างชุดแบ็คเอนด์และการปรับระบบภายในการตรวจสอบง่ายๆ
ชุด RT-qPCR โดยตรงโดยใช้ Foreasy Reverse Transcriptase และ Foreasy HS Taq DNA Polymerase ที่พัฒนาโดย Foregene พร้อมบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาเฉพาะ ทำให้ชุดนี้มีความต้านทานสูงและเข้ากันได้ และสามารถทดสอบปฏิกิริยาได้โดยตรงโดยใช้ระบบ Foregene Lysis เป็นแม่แบบชุดนี้สามารถใช้กับชุดตรวจหากรดนิวคลีอิกของ COVID-19 และการพัฒนาชุดตรวจหากรดนิวคลีอิกของแบคทีเรียก่อโรคอื่นๆ
ชุดอุปกรณ์นี้สามารถเป็นส่วนประกอบของผลิตภัณฑ์ IVD ได้โดยตรง ใช้งานง่ายและรวดเร็วต้องการเพียงการยืนยันง่ายๆ โดยไม่ต้องพัฒนาอีก
ข้อมูลจำเพาะ
500T, 50,000T
ส่วนประกอบของชุด
เนื้อหาชุด (ระบบปฏิกิริยา 20 ไมโครลิตร) | IM-05111-03 | IM-05112-03 |
500 ต | 50,000 ต | |
ฟอร์อีซี่ อาร์Everse Transcriptase(200 ยู/μL) | 50 ไมโครลิตร×1 | 1 มล×5 |
2× qPCR โดยตรงมิกซ์-แท็คแมน | 1 มล. ×5 | 500 มล×1 |
คำแนะนำ | 1 | 1 |
ขั้นตอนการดำเนินงาน
A: เตรียมแม่แบบและน้ำยา
1. เตรียมเทมเพลต RNA ที่เตรียมไว้ (แนะนำให้ใช้ชุดคิท Foregene Total RNA Isolation Kit เพื่อแยกและทำให้เทมเพลต RNA บริสุทธิ์) หรือตัวอย่างผลิตภัณฑ์แคร็ก (แนะนำให้ใช้ระบบ Foregene Lysis) ไพรเมอร์เฉพาะ (10 μM) และอุปกรณ์สิ้นเปลืองอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง เครื่องมือ
2. ใส่ 2× Direct RT-qPCR Buffer, RNase-Free ddH2O และ 20× ROX Reference Dye (หากจำเป็น) ลงในกล่องที่มีน้ำแข็ง ทำให้สิ่งเหล่านี้ละลายตามธรรมชาติ และผสมอย่างเบามือ
B: เตรียมระบบ RT-qPCR
รับปริมาตรครึ่งหนึ่งของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาของระบบปฏิกิริยา (เช่น ถ้าปริมาตรของระบบคือ 20 μL จะต้องได้รับ 10 μL 2× Direct RT-qPCR Buffer). สำหรับปริมาณเอนไซม์ที่สอดคล้องกันเราขอแนะนำว่าM-MLV:ระบบปฏิกิริยา 10-30 U/20 μL,แท็กดีเอ็นเอโพลิเมอเรส:ระบบปฏิกิริยา 1-2 U/20 μLนี่คือคำแนะนำของเรา คุณควรทดสอบและปรับเปลี่ยน) เพิ่มเทมเพลต RNA ไพรเมอร์และโพรบเฉพาะ และเพิ่ม RNase-Free ddH2O ถึง 20 ไมโครลิตรการเตรียมเฉพาะของระบบปฏิกิริยา RT-qPCR สามารถอ้างอิงได้จากตารางที่ 1 ต่อไปนี้
ตารางที่ 1 จัดเตรียมระบบ RT-qPCR
ส่วนประกอบ | ปริมาณ | ความเข้มข้นขั้นสุดท้าย |
บัฟเฟอร์ RT-qPCR โดยตรง 2 เท่า | 10 ไมโครลิตร | 1× |
Foreasy Reverse Transcriptase (MMLV) | 10-30 ยู | |
Foreasy HS Taq DNA Polymerase | 1-2 ยู | |
ไพรเมอร์ไปข้างหน้า (10 μM) | 0.8 ไมโครลิตร | 50-900nM |
รองพื้นย้อนกลับ (10 μM) | 0.8 ไมโครลิตร | 50-900nM |
โพรบ (4 μM) | 1 ไมโครลิตร | 200nM |
เทมเพลต (RNA หรือ Lysate) | X ไมโครลิตร | |
20× ROX สีย้อมอ้างอิง | - | 1* |
RNase-FreeddH2O | (6.4-X) ไมโครลิตร | |
ปริมาณรวม | 20 ไมโครลิตร |
หมายเหตุ: Forward Primer และ Reverse Primer เป็นไพรเมอร์เฉพาะของยีนเป้าหมายระบบของ qPCR สามารถปรับได้ตามแบบจำลองการทดลองและ PCRเราขอแนะนำ 400nM สำหรับความเข้มข้นสุดท้ายของไพรเมอร์ส่วนใหญ่โปรดปรับปริมาตรของไพรเมอร์และโพรบตามความเข้มข้นที่เตรียมไว้และความเข้มข้นสุดท้ายที่แนะนำ
1*: เลือกความเข้มข้นสุดท้ายของ ROX Reference Dye ตามเครื่องมือ PCR เชิงปริมาณที่แตกต่างกันความเข้มข้น ROX Reference Dye ที่เหมาะสมที่สุดของเครื่องมือ PCR เชิงปริมาณทั่วไปแสดงไว้ในตารางต่อไปนี้:
เครื่องมือ PCR เชิงปริมาณ | ความเข้มข้นสุดท้ายของ ROX Reference Dye |
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/ขั้นตอนที่หนึ่งเป็นต้น | 1× (ตัวอย่างเช่น เพิ่ม 1μl 20×ROX Reference Dye ในระบบปฏิกิริยา 20 μL) |
ABI 7500, 7500 Fast, Stratagene Mx3000P, Mx3005P และ Mx4000 เป็นต้น | 0.5× (ตัวอย่างเช่น เพิ่ม 0.5μl 20×ROX Reference Dye ในระบบปฏิกิริยา 20 μL) |
เครื่องมือ Roche PCR, เครื่องมือ Bio-Rad PCR, เครื่องมือ Eppendorf เชิงปริมาณ PCR เป็นต้น | ไม่มี ROX Reference Dye |
การจัดเก็บและอายุการเก็บรักษา
ควรเก็บชุดอุปกรณ์ไว้ที่ -20 ± 5°Cควรเก็บไว้ในตู้เย็นอุณหภูมิ -20°C ทันทีอายุการใช้งานคือ 2 ปีหากเก็บไว้ในสภาพที่เหมาะสม