ไม่มีการสกัด RNA หรือผลผลิต RNA ต่ำ

มักจะมีปัจจัยหลายอย่างที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพการกู้คืน เช่น: ปริมาณ RNA ของตัวอย่างเนื้อเยื่อ วิธีการดำเนินการ ปริมาณการชะ ฯลฯ

1. ดำเนินการหมุนเหวี่ยงในอ่างน้ำแข็งหรือไครโอเจนิก (4 °C) ระหว่างการทำงาน

คำแนะนำ: ใช้งานที่อุณหภูมิห้อง (15-25°C) ตลอดกระบวนการทั้งหมด ห้ามแช่น้ำแข็งและหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิต่ำ

2. การเก็บรักษาตัวอย่างที่ไม่เหมาะสมหรือเวลาเก็บตัวอย่างมากเกินไป

คำแนะนำ: เก็บตัวอย่างที่อุณหภูมิ -80 °C หรือแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และหลีกเลี่ยงการใช้น้ำแข็งละลายซ้ำๆพยายามใช้เนื้อเยื่อสดหรือเซลล์เพาะเลี้ยงในการสกัด RNA

3. การสลายตัวอย่างไม่เพียงพอ

คำแนะนำ: เมื่อทำการทำให้เนื้อเยื่อเป็นเนื้อเดียวกัน ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันเพียงพอ และเซลล์เนื้อเยื่อถูกแยกออกอย่างเพียงพอเพื่ออธิบายการปลดปล่อย RNA

4. เติมตัวชะไม่ถูกต้อง

คำแนะนำ: ยืนยันว่า RNase-Free ddH₂O จะถูกเพิ่มทีละหยดที่ตรงกลางของเมมเบรนของคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์

5. ไม่ได้เติมเอทานอลสัมบูรณ์ในปริมาตรที่ถูกต้องลงใน Buffer RL2 หรือ Buffer RW2

คำแนะนำ: ทำตามคำแนะนำ เติมเอทานอลสัมบูรณ์ในปริมาตรที่ถูกต้องลงใน Buffer RL2 และ Buffer RW2 แล้วผสมให้เข้ากันก่อนใช้ชุด

6. ปริมาณตัวอย่างเนื้อเยื่อไม่เหมาะสม

คำแนะนำ: ใช้ทิชชู่ 10-20 มก. หรือ (1-5) × 10⁶เซลล์ต่อบัฟเฟอร์ 500 ไมโครลิตร RL1 เนื่องจากการใช้เนื้อเยื่อมากเกินไปอาจส่งผลให้การสกัด RNA ลดลง

7. ปริมาณการชะที่ไม่เหมาะสมหรือการชะที่ไม่สมบูรณ์

คำแนะนำ: ปริมาณการชะของคอลัมน์ทำให้บริสุทธิ์คือ 50-200 ไมโครลิตร;หากผลการชะไม่เป็นที่พอใจ ขอแนะนำให้ยืดเวลาการจัดวางที่อุณหภูมิห้องหลังจากเพิ่ม ddH ที่ปราศจาก RNase ที่อุ่นแล้ว₂O เช่น 5-10 นาที

8.คอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์มีเอธานอลตกค้างหลังจากการล้างบัฟเฟอร์ RW2

คำแนะนำ: หากมีเอทานอลตกค้างหลังจากการล้างบัฟเฟอร์ RW2 ให้ปั่นแยกหลอดเปล่าเป็นเวลา 1 นาที เวลาสำหรับการปั่นแยกหลอดเปล่าสามารถเพิ่มเป็น 2 นาที หรือสามารถวางคอลัมน์ทำให้บริสุทธิ์ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อกำจัดเอทานอลที่ตกค้างอย่างเพียงพอ

RNA บริสุทธิ์ถูกย่อยสลาย

คุณภาพของ RNA ที่บริสุทธิ์เกี่ยวข้องกับปัจจัยต่างๆ เช่น การเก็บรักษาตัวอย่าง การปนเปื้อนของ RNase และการจัดการ เป็นต้น

1. เก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อไม่ทันเวลา

คำแนะนำ: หากตัวอย่างเนื้อเยื่อหรือเซลล์ไม่ได้ใช้ในเวลาที่เหมาะสมหลังการเก็บ ให้เก็บรักษาด้วยความเย็นทันทีที่อุณหภูมิ -80 °C หรือไนโตรเจนเหลวในการแยก RNA ให้ใช้ตัวอย่างเนื้อเยื่อหรือเซลล์ที่เพิ่งถ่ายเมื่อทำได้

2. การละลายน้ำแข็งซ้ำของตัวอย่างเนื้อเยื่อ

คำแนะนำ: เมื่อเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อ ทางที่ดีควรตัดเป็นชิ้นเล็กๆ เพื่อการเก็บรักษา และนำชิ้นใดชิ้นหนึ่งออกเมื่อใช้เพื่อหลีกเลี่ยงการละลายน้ำแข็งซ้ำของตัวอย่างและการย่อยสลายของ RNA

3. แนะนำให้ใช้ RNase หรือไม่สวมถุงมือ หน้ากาก ฯลฯ ในระหว่างการผ่าตัด

คำแนะนำ: การทดลองสกัด RNA ทำได้ดีที่สุดในห้องปรับแต่ง RNA ที่แยกจากกัน และล้างตารางก่อนการทดลอง

สวมถุงมือและหน้ากากแบบใช้แล้วทิ้งในระหว่างการทดลองเพื่อลดการย่อยสลาย RNA ที่เกิดจากการแนะนำของ RNase

4. รีเอเจนต์ปนเปื้อน RNase ระหว่างการใช้งาน

คำแนะนำ: แทนที่ด้วย Animal Total RNA Isolation Kit ใหม่สำหรับการทดลองที่เกี่ยวข้อง

5. หลอดปั่นแยก ทิป ฯลฯ ที่ใช้ในการจัดการ RNA ปนเปื้อน RNase

คำแนะนำ: ยืนยันว่าหลอด centrifuge ทิป ปิเปต ฯลฯ ที่ใช้ในการสกัด RNA นั้นปราศจาก RNase ทั้งหมด

RNA ที่ได้รับบริสุทธิ์จะส่งผลต่อการทดลองขั้นปลาย

RNA บริสุทธิ์โดยคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ ถ้าไอออนเกลือ ปริมาณโปรตีนมากเกินไปจะส่งผลต่อการทดลองปลายน้ำ เช่น: การถอดความแบบย้อนกลับ Northern Blot et al.

1. RNA ที่ถูกชะออกมีเกลือไอออนตกค้าง

คำแนะนำ: ยืนยันว่าได้เติมเอทานอลในปริมาตรที่ถูกต้องใน Buffer RW2 และทำการล้างคอลัมน์ทำให้บริสุทธิ์ 2 ครั้งด้วยความเร็วแรงเหวี่ยงที่ระบุสำหรับการทำงานหากมีเกลือไอออนตกค้าง ให้ปล่อยคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ไว้ที่ Buffer RW2 เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และทำการปั่นแยกเพื่อกำจัดการปนเปื้อนของเกลือให้ได้มากที่สุด

2. เอทานอลตกค้างใน RNA ที่ชะล้าง

คำแนะนำ: ยืนยันว่าหลังจากการล้างบัฟเฟอร์ RW2 ให้ดำเนินการหมุนเหวี่ยงหลอดเปล่าที่ความเร็วการหมุนเหวี่ยงที่ระบุสำหรับการทำงาน เพิ่มเวลาของการดำเนินการหมุนเหวี่ยงหลอดเปล่าเป็น 2 นาทีหากยังมีเอทานอลตกค้างอยู่ หรือปล่อยทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 เมตร