เราเป็นผู้ผลิตที่มีประสบการณ์ชนะเสียงข้างมากในการรับรองที่สำคัญของตลาดสำหรับการลดราคาครั้งใหญ่ของโพรบขั้นตอนเดียวความไวสูงของจีน Rt-คิวพีอาร์Kit V2, คุณภาพชีวิตของโรงงาน, การมุ่งเน้นความต้องการของลูกค้าเป็นแหล่งที่มาของการอยู่รอดและการพัฒนาของ บริษัท, เรายึดมั่นในความซื่อสัตย์สุจริตและทัศนคติที่ดีในการทำงาน, รอคอยการมาของคุณ!
เราเป็นผู้ผลิตที่มีประสบการณ์ชนะส่วนใหญ่ในการรับรองที่สำคัญของตลาดสำหรับChina Taq DNA พอลิเมอเรส, คิวพีอาร์, บริษัทของเราสัญญา: ราคาที่เหมาะสม, เวลาในการผลิตสั้นและบริการหลังการขายที่น่าพอใจ, เรายังยินดีต้อนรับคุณเข้าเยี่ยมชมโรงงานของเราได้ตลอดเวลาที่คุณต้องการขอให้ตอนนี้เรามีธุรกิจที่น่าพึงพอใจและระยะยาวด้วยกัน!!!

คำอธิบาย

ชุดนี้ใช้ระบบบัฟเฟอร์สลายเฉพาะที่สามารถปลดปล่อย RNA จากตัวอย่างเซลล์เพาะเลี้ยงสำหรับปฏิกิริยา RT-qPCR ได้อย่างรวดเร็ว จึงช่วยขจัดกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ RNA ที่ใช้เวลานานและลำบากสามารถรับเทมเพลต RNA ได้ในเวลาเพียง 7 นาทีรีเอเจนต์ 5×Direct RT Mix และ 2×Direct qPCR Mix-SYBR ที่ให้มาในชุดสามารถรับผล PCR เชิงปริมาณตามเวลาจริงได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ

5×Direct RT Mix และ 2×Direct qPCR Mix-SYBR มีความทนทานต่อสารยับยั้งสูง และ lysate ของตัวอย่างสามารถใช้เป็นแม่แบบสำหรับ RT-qPCR ได้โดยตรงชุดนี้ประกอบด้วย RNA รีเวิร์สทรานสคริปเทสที่มีสัมพรรคภาพสูงที่ไม่เหมือนใคร และ Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา, สารเพิ่มประสิทธิภาพ PCR และสารทำให้คงตัว

ข้อมูลจำเพาะ

Rxns 200×20μl, Rxns 1,000×20μl

ส่วนประกอบของชุด

คุณสมบัติและข้อดี

■ ง่ายและมีประสิทธิภาพ : ด้วยเทคโนโลยี Cell Direct RT สามารถรับตัวอย่าง RNA ได้ในเวลาเพียง 7 นาที

■ ความต้องการตัวอย่างมีขนาดเล็ก สามารถทดสอบได้ต่ำถึง 10 เซลล์

■ ปริมาณงานสูง: สามารถตรวจจับ RNA ได้อย่างรวดเร็วในเซลล์ที่เพาะเลี้ยงในเพลต 384, 96, 24, 12, 6 หลุม

■ DNA Eraser สามารถลบจีโนมที่ปล่อยออกมาได้อย่างรวดเร็ว ลดผลกระทบอย่างมากต่อผลการทดลองที่ตามมา

■ ระบบ RT และ qPCR ที่ปรับให้เหมาะสมทำให้การถอดความย้อนกลับ RT-PCR สองขั้นตอนมีประสิทธิภาพมากขึ้น และ PCR เฉพาะเจาะจงมากขึ้น และทนทานต่อสารยับยั้งปฏิกิริยา RT-qPCR มากขึ้น

แอปพลิเคชันชุด

ขอบเขตการใช้งาน: เซลล์เพาะเลี้ยง

- RNA ที่ปล่อยออกมาโดยการสลายตัวอย่าง: ใช้ได้กับเทมเพลต RT-qPCR ของชุดนี้เท่านั้น

- ชุดนี้สามารถใช้เพื่อวัตถุประสงค์ดังต่อไปนี้: การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การตรวจสอบผลการทำให้เงียบของยีนที่ใช้ siRNA สื่อกลาง การคัดกรองยา ฯลฯ

แผนภาพ

การจัดเก็บและอายุการเก็บรักษา

ส่วน I ของชุดนี้ควรเก็บไว้ที่ 4 ℃;ส่วนที่สองควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 ℃

Foregene Protease Plus II ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃ ห้ามแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 ℃

รีเอเจนต์ 2×Direct qPCR Mix-SYBR ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C ในที่มืดหากใช้บ่อยสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อการจัดเก็บระยะสั้น (ใช้ให้หมดภายใน 10 วัน) เราเป็นผู้ผลิตที่มีประสบการณ์ชนะส่วนใหญ่ในการรับรองที่สำคัญของตลาดสำหรับการลดราคาครั้งใหญ่ของ China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2 คุณภาพคือชีวิตของโรงงาน การมุ่งเน้นที่ความต้องการของลูกค้าคือแหล่งที่มาของการอยู่รอดและการพัฒนาของ บริษัท เรายึดมั่นในความซื่อสัตย์สุจริตและทัศนคติที่ดีในการทำงานโดยรอคอยการมาของคุณ!
ส่วนลดใหญ่China Taq DNA พอลิเมอเรส, Qpcr บริษัทของเราสัญญา: ราคาที่เหมาะสม เวลาในการผลิตสั้น และบริการหลังการขายที่น่าพอใจ เรายังยินดีต้อนรับคุณเข้าเยี่ยมชมโรงงานของเราได้ตลอดเวลาที่คุณต้องการขอให้ตอนนี้เรามีธุรกิจที่น่าพึงพอใจและระยะยาวด้วยกัน!!!

QuickEใช่TM Cell Direct RT-qพีซีอาร์ Kit -แท็กมan

เลขที่ มท.-01021/01022

สำหรับเซลล์โดยตรง RT-qPCR โดยใช้ ≤ 1,000,000 เซลล์

การแนะนำสินค้า

ผลิตภัณฑ์นี้ใช้ระบบบัฟเฟอร์การสลายตัวที่ไม่เหมือนใครเพื่อปลดปล่อย RNA จากตัวอย่างเซลล์เพาะเลี้ยงสำหรับปฏิกิริยา RT-qPCR อย่างรวดเร็ว ขจัดกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ RNA ที่ใช้เวลานานและลำบาก และใช้เวลาเพียง 7 นาทีในการรับเทมเพลต RNA ที่ต้องการ ด้วย Direct RT Mix 5 เท่า, Direct qPCR Mix-Taqman 2 เท่าที่ได้รับจากชุดอุปกรณ์ จึงสามารถรับผล PCR เชิงปริมาณตามเวลาจริงได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ

5× Direct RT Mix และ 2× Direct qPCR Mix-Taqman มีความทนทานต่อสารยับยั้งสูงและสามารถทำการย้อนกลับที่มีประสิทธิภาพและการขยายเฉพาะโดยใช้ lysate ของตัวอย่างที่จะวัดเป็นแม่แบบรีเอเจนต์ประกอบด้วย Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer และ Stabilizer ซึ่งสามารถใช้กับ lysis buffer เพื่อตรวจจับตัวอย่างได้อย่างรวดเร็วและง่ายดาย และมีคุณลักษณะของความไว ความจำเพาะ และความเสถียรสูง

คุณสมบัติของสินค้า

เทคโนโลยี Cell Direct RT ที่ง่ายและมีประสิทธิภาพ ใช้เวลาเพียง 7 นาทีในการรับตัวอย่าง RNA

ความต้องการตัวอย่างมีน้อย และเซลล์เพาะเลี้ยงขั้นต่ำ 10 เซลล์สามารถใช้สำหรับการทดลองได้

ปริมาณงานสูงสำหรับการได้มาซึ่ง RNA อย่างรวดเร็วของเซลล์เพาะเลี้ยง เช่น เพลต 384, 96, 24, 12 และ 6 หลุม

DNA Eraser สามารถลบจีโนมที่ปล่อยออกมาได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งช่วยลดผลกระทบอย่างมากต่อผลการทดลองที่ตามมา

ระบบ RT และ qPCR ที่ปรับให้เหมาะสมช่วยให้ RT-PCR แบบสองขั้นตอนพร้อมการถอดความแบบย้อนกลับที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น ความจำเพาะ และความทนทานต่อสารยับยั้งปฏิกิริยา RT-qPCR ที่แข็งแกร่งขึ้น

แอปพลิเคชันชุด

ขอบเขตการใช้งาน: เซลล์เพาะเลี้ยง

การสลายตัวอย่างตีความ RNA: ใช้เป็นเทมเพลต RT-qPCR สองขั้นตอนเท่านั้น

สามารถใช้ชุดเครื่องมือเพื่อวัตถุประสงค์ต่อไปนี้: การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การทดสอบอัลลีล การตรวจหาสารเสพติด ฯลฯ

ข้อจำกัดของชุด

ชิ้นส่วนขยาย≤ 300 bp

ชุดอุปกรณ์ใช้ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ใหม่

การควบคุมคุณภาพของผลิตภัณฑ์

ตามระบบการจัดการคุณภาพโดยรวมของ FOREGENE ชุดอุปกรณ์ซีรีส์ Cell Direct RT-qPCR แต่ละชุดได้รับการทดสอบอย่างเข้มงวดหลายครั้งเพื่อให้มั่นใจในความน่าเชื่อถือและความเสถียรของคุณภาพของชุดอุปกรณ์แต่ละชุด

เนื้อหาชุด

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman สามารถซื้อแยกต่างหาก รายละเอียดอยู่ในภาคผนวก 1 (หน้า 13)

สภาพการเก็บรักษา

1. เงื่อนไขการจัดส่ง

กระบวนการทั้งหมดของการขนส่งกล่องแพ็คน้ำแข็งอุณหภูมิต่ำเพื่อให้แน่ใจว่าชุดอุปกรณ์อยู่ในสถานะ <4 °C

2. สภาพการเก็บรักษา

เก็บส่วน I ที่อุณหภูมิ 4°C และส่วน II ที่อุณหภูมิ -20°C

ควรเก็บ Foregene Protease Plus II ที่อุณหภูมิ 4°C ไม่แช่แข็งที่อุณหภูมิ -20°C

รีเอเจนต์ 2× Direct qPCR Mix-Taqman เก็บไว้ที่ -20°C หรือที่ 4°C สำหรับการใช้งานระยะสั้นหากใช้บ่อย (ภายใน 10 วัน)

ข้อมูลส่วนประกอบของชุดอุปกรณ์

บัฟเฟอร์ CL: จัดเตรียมสภาพแวดล้อมที่จำเป็นสำหรับปฏิกิริยาการสลายตัวของเซลล์

Buffer ST: ยุติสารออกฤทธิ์ใน lysate เพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบต่อ RT ที่ตามมา

DNA Eraser: ตัวกำจัด DNA ผลของการลบจีโนมในการทดลองที่ตามมา

5× Direct RT Mix: ประกอบด้วย RNA affinity สูง Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, Stabilizer, Enhancers, Optimizer และ Reverse Transcription Primer สำหรับการจัดตำแหน่งที่เหมาะสมที่สุด (Random Primer, Oligo(dT)₁₈ไพรเมอร์).

Foregene Protease Plus II: ในบริบทของ lysis buffer เซลล์จะถูก lysed เพื่อปลดปล่อยกรดนิวคลีอิก

2× Direct qPCR Mix-Taqman: รีเอเจนต์นี้ประกอบด้วย Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา, PCR Optimizer และ Stabilizer

20× ROX Reference Dye: โดยทั่วไปใช้กับเครื่องมือขยายสัญญาณ PCR แบบเรียลไทม์ของ ABI, Stratagene และบริษัทอื่นๆ ใช้เพื่อปรับความแตกต่างระหว่างหลอด PCR และหลอดที่เกิดจากข้อผิดพลาดในการเติม PCRความเข้มข้น 20× ROX Reference Dye ที่จำเป็นสำหรับเครื่องมือต่างๆ นั้นแตกต่างกัน และผู้ใช้สามารถเพิ่มได้ตามความเข้มข้นที่แนะนำของอุปกรณ์

RNase ฟรี ddH₂O: น้ำบริสุทธิ์พิเศษปราศจาก RNase สำหรับปฏิกิริยา RT-qPCR สองขั้นตอน

ข้อควรระวัง:(โปรดอ่านข้อควรระวังอย่างละเอียดก่อนใช้ชุด)

ให้ความสนใจกับวิธีการทำงานของการทดลองเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามระหว่างตัวอย่าง

ใส่ใจกับความสะอาดของสภาพแวดล้อมการทดลองและเครื่องใช้เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของ RNase และการย่อยสลายของ RNA

เก็บตัวอย่างเซลล์ที่สดหรือเซลล์ที่เก็บรักษาไว้อย่างดี และอย่าใช้ตัวอย่างเซลล์ที่ละลายน้ำแข็งซ้ำๆ

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ควรหลีกเลี่ยงการแช่แข็ง-ละลายซ้ำๆ มิฉะนั้นจะส่งผลต่อการถอดรหัสแบบย้อนกลับและประสิทธิภาพของ PCR

เตรียมปันส่วนก่อนการดำเนินการ

โปรดอ่านคำแนะนำอย่างละเอียดก่อนใช้ชุดนี้ชุดอุปกรณ์ Cell Direct RT-qPCR ใช้งานง่าย สะดวก และรวดเร็ว และคำแนะนำจะให้ข้อมูลที่สมบูรณ์เกี่ยวกับชุดอุปกรณ์ทั้งหมดและวิธีใช้งานอย่างถูกต้องโปรดเตรียมวัสดุและอุปกรณ์การทดลองที่จำเป็นก่อนใช้งาน

วัสดุและอุปกรณ์การทดลอง

◆ เซลล์เพาะเลี้ยง

◆ 1.5 มล. หรือ 2 มล., หลอดหมุนเหวี่ยงปราศจาก RNase/DNase, ปลายปราศจาก RNase/DNase, หลอด qPCR ปลอดเชื้อ 0.2 มล.

◆ เครื่อง qPCR, ปิเปต, เครื่องหมุนเหวี่ยงแบบตั้งโต๊ะ (≥13,400×g) (ขึ้นอยู่กับความต้องการในการทดลอง) ฯลฯ

ความปลอดภัย

◆ ผลิตภัณฑ์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยทางวิทยาศาสตร์เท่านั้น โปรดอย่าใช้เพื่อจุดประสงค์ด้านเภสัชกรรม คลินิก อาหาร และเครื่องสำอาง

◆ เมื่อใช้สารเคมี ให้สวมเสื้อผ้าห้องปฏิบัติการ ถุงมือ แว่นตาป้องกัน ฯลฯ ที่เหมาะสม

การดำเนินการคู่มือ

ระบบสลายเซลล์ ระบบ RT และชุดเสริมสารละลายปฏิกิริยา qPCR สามารถซื้อแยกต่างหาก สำหรับรายละเอียดในภาคผนวก 1 (หน้า 13)

คู่มือการใช้งาน

ตอบ: ตัวอย่างการปล่อย RNA

1. เซลล์ถูกเตรียมล่วงหน้า: ล้างจานเพาะเลี้ยงเซลล์ด้วย PBS เย็น จากนั้นแยกเซลล์ (10-10⁶), 10⁶ แนะนำให้ใช้ Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) หรือ Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) สำหรับการสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ RNA

1.1.เซลล์ยึดติด (ตัวอย่างเพลท 24 หลุม)

1.1.1.กำหนดจำนวนเซลล์ในแต่ละหลุม กำหนดว่า จำนวนเซลล์คือ 1 × 10⁵และใช้ปิเปตเพื่อนำอาหารเลี้ยงเชื้อออกจากจานเพาะเชื้อ

1.1.2.เติม 1 × PBS แช่เย็นล่วงหน้า 200 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุมอย่าปิเปตซ้ำๆ และนำ PBS ออกจากหลุมเอียงจานและนำ PBS ออกให้ได้มากที่สุดดำเนินการต่อไปยังขั้นตอนที่ 2

1.1.3.จานเพาะเลี้ยงเซลล์ที่แตกต่างกันหรือตารางหมายเลขอ้างอิง 1-1 ในจานเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกเติมด้วย precooled 1 × PBS สำหรับการล้างเซลล์

ตารางที่ 1-1: ปริมาณ PBS สำหรับจำนวนเซลล์ต่างๆ

บันทึก：เพื่อให้เซลล์ยึดติดแน่น，หลีกเลี่ยงการสูญเสียเซลล์จำนวนมากเมื่อล้าง

1.2.เซลล์แขวนลอยหรือเซลล์ยึดติดที่เลี้ยงในแผ่นที่ไม่มีรูพรุน

1.2.1.เซลล์ยึดติดที่เลี้ยงในจานที่ไม่ใช่หลายหลุม (เซลล์แขวนลอยเริ่มต้นจากขั้นตอนถัดไป 1.2.2) รวบรวมและแยกเซลล์ตามวิธีการเก็บเซลล์ปกติ และวางไว้ในจานเพาะเลี้ยงหรือหลอดปั่นแยกหากใช้ทริปซิไนเซชัน ต้องใช้การหมุนเหวี่ยงเพื่อรวบรวมเซลล์และเพื่อกำจัดทริปซินที่ตกค้าง เพิ่มเซลล์ที่แขวนลอย PBS ลงในแต่ละเซลล์เพื่อกระจายเซลล์

1.2.2.หลังจากนับจำนวนเซลล์แล้ว ให้แบ่งเซลล์ออกเป็น 1×10⁵ หนึ่งไปยังหลอดปั่นแยก เก็บเซลล์โดยการปั่นแยกที่ 1,000 × g เป็นเวลา 10 นาที

1.2.3.เติม PBS 200 ไมโครลิตรลงในหลอดปั่นแยก อย่าปิเปตซ้ำๆ และดูด PBS โดยตรงดำเนินการขั้นตอนที่ 2 (หากตกตะกอนได้ยากและเซลล์ถูกแขวนลอยอีกครั้ง อาจทำการปั่นแยก 1,000×g 10 นาที หลังจากทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอนแล้ว เม็ดเซลล์ดำเนินการต่อไปยังขั้นตอนที่ 2)

2. การสลายเซลล์: กำจัด Buffer CL, อุณหภูมิที่สมดุลกับอุณหภูมิห้อง, DNA Eraser และ Foregene Protease Plus II ตามตารางที่ 1-2 ระบบการสลายที่เตรียมไว้ต่อไปนี้: (สารละลายสลายพร้อมใช้งานแล้ว)

ตารางที่ 1-2: ความแตกแยก การเตรียมระบบ (หมายเหตุ: ในการเตรียมน้ำแข็ง)

3.(ตัวอย่างจาน 24 หลุม) ปิเปต 200 ไมโครลิตรของ cell lysis master ผสมลงในแต่ละหลุม เป่าซ้ำ 5-10 ครั้ง บ่มที่อุณหภูมิห้อง (20-25 ℃) เป็นเวลา 5 นาที

บันทึก：เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดฟอง โปรดปรับมาตราส่วนปิเปตปิเปตเป็น 200μl หรือน้อยกว่าเซลล์อาจมีสีขุ่นหลังการสลาย ซึ่งเป็นเรื่องปกติ

4.(ตัวอย่างจาน 24 หลุม) ถูกเติมในของเหลว 20 ไมโครลิตร Buffer ST (ระบบ lysis ที่แตกต่างกัน Buffer ST เพิ่มในปริมาณที่แสดงในตารางที่ 1-3) ปิเปตซ้ำ 5-10 ครั้ง ที่อุณหภูมิห้อง (20-25 ℃) ถูกบ่มเป็นเวลา 2 นาที

บันทึก：ปลายปิเปตถูกทิ้งใต้พื้นผิว เพื่อให้แน่ใจว่าได้เพิ่มไลเซทแล้ว，เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดฟอง โปรดปรับมาตราส่วนปิเปตปิเปตเป็น 200μl หรือน้อยกว่า

ตารางที่ 1-3：เพิ่มบัฟเฟอร์ ST

5. ไลเซทใช้สำหรับการทดลอง RT-qPCR ในภายหลังหากไม่สามารถทำการทดลองครั้งต่อไปได้ทันเวลา โปรดเก็บไว้ในน้ำแข็งไม่เกิน 2 ชั่วโมง และเก็บที่อุณหภูมิ -20℃ หรือ -80℃ (ไม่เกินสามเดือน)

B: RT การจัดทำระบบ

1.นำ 5 × Direct RT Mix ออกมาวางบนอ่างน้ำแข็ง ปล่อยให้ละลายตามธรรมชาติ แล้วค่อยๆ ผสมเพื่อใช้ในภายหลังนำ ddH2O ที่ปราศจาก RNase ออกมาละลายและวางบนอ่างน้ำแข็งเพื่อใช้ในภายหลังเตรียมระบบปฏิกิริยาบนน้ำแข็งตามตาราง 2-1 ด้านล่าง

ตารางที่ 2-1: การเตรียมระบบปฏิกิริยา RT

2.หลังจากเสร็จสิ้นการผสมสูตรระบบ ให้ผสมอย่างเบามือและหมุนเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ ในตาราง 2 -2 เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยา ปฏิกิริยา RT ต่อไปนี้

ตารางที่ 2-2: การตั้งค่าสภาวะปฏิกิริยา RT

3.หลังจากเสร็จสิ้นปฏิกิริยา ผลิตภัณฑ์ที่ทำปฏิกิริยาจะถูกวางบนน้ำแข็งโดยตรงสำหรับ qPCR โปรดใส่การเก็บรักษาระยะยาว -20 ℃ หรือ -80 ℃

หมายเหตุ: เนื่องจากการใช้แม่แบบที่ไม่บริสุทธิ์ อาจมีตะกอนสีขาวปรากฏขึ้นในผลิตภัณฑ์การถอดความแบบย้อนกลับนี่เป็นปรากฏการณ์ปกติปั่นแยกส่วนลอยน้ำทันทีสำหรับการทดลองครั้งต่อไป

สารละลายปฏิกิริยา RT ที่เป็นผลลัพธ์จะถูกเพิ่มลงในระบบปฏิกิริยา PCR แบบเรียลไทม์ขั้นถัดไป ขอแนะนำให้เพิ่มปริมาณตั้งแต่ 10-30% ของระบบปฏิกิริยา

C: การเตรียมระบบปฏิกิริยา qPCR

1. ปริมาณ B ที่เหมาะสมที่เตรียมในขั้นตอน cDNA template ตามตาราง 3-1 ​​ต่อไปนี้ เพื่อเตรียมระบบปฏิกิริยา

หมายเหตุ: จำนวนเทมเพลต cDNA คิดเป็น 10-30% ของระบบ qPCRตัวอย่างเช่น ในระบบ 20μl qPCR ให้เพิ่ม lysis buffer 2-6 μl แต่ไม่เกิน 6 μl

2.การปรับสภาวะ qPCR ที่ดีให้เหมาะสม (อุณหภูมิการหลอม ฯลฯ) สำหรับปฏิกิริยา qPCR (สภาวะการเกิดปฏิกิริยาที่ระบุในตารางที่ 3-2)

หมายเหตุ: พยายามใช้สภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับปฏิกิริยา qPCR เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น

ตารางที่ 3-1: การเตรียมระบบปฏิกิริยา PCR

1*: ความเข้มข้นของไพรเมอร์สามารถปรับได้ในช่วง 50-900 nM เมื่อประสิทธิภาพการทำปฏิกิริยาของไพรเมอร์ต่ำ

หมายเหตุ: ระบบ qPCR สามารถปรับได้ตามความต้องการในการทดลองและรุ่นของวงจรเรืองแสงสำหรับ qPCR ใน 50μl ระบบ ปรับขนาดยาตามสัดส่วนตาม 20μระบบล.

2*: เลือกความเข้มข้นสุดท้ายที่เหมาะสมของ ROX Reference Dye ตามวงจรความร้อนเชิงปริมาณเรืองแสงความเข้มข้นของ ROX Reference Dye ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับไซเคิลเชิงปริมาณฟลูออเรสเซนส์ทั่วไปแสดงไว้ในตารางด้านล่าง:

ตารางที่ 3-2: เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยา qPCR ถูกจัดเตรียมไว้

หมายเหตุ: เพื่อให้ได้เอฟเฟกต์ qPCR ที่ดีที่สุด สามารถใช้ Gradient PCR เพื่อปรับสภาวะการเกิดปฏิกิริยาให้เหมาะสมที่สุดสำหรับเทมเพลตและไพรเมอร์ที่แตกต่างกันเงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยา PCR แตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับเครื่องวิเคราะห์ฟลูออเรสเซนซ์ แม่แบบ ไพรเมอร์ ฯลฯ ในการทำงานเฉพาะ เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาที่เหมาะสมที่สุดจำเป็นต้องออกแบบตามเงื่อนไขเฉพาะของวงจรความร้อนเชิงปริมาณฟลูออเรสเซนซ์ ประเภทของแม่แบบ ขนาดของชิ้นส่วนที่สนใจ ลำดับฐานของชิ้นส่วนขยายและเนื้อหา GC และความยาวของไพรเมอร์ รวมถึงอุณหภูมิการหลอม เวลาปฏิกิริยา ฯลฯ

หลักการออกแบบไพรเมอร์แบบเรียลไทม์ PCR

ไพรเมอร์ไปข้างหน้าและไพรเมอร์ย้อนกลับ

สำหรับ Real Time PCR การออกแบบไพรเมอร์มีความสำคัญมากไพรเมอร์เกี่ยวข้องกับความจำเพาะและประสิทธิภาพของการขยาย PCR และสามารถออกแบบโดยอ้างอิงถึงหลักการต่อไปนี้:

◆ ความยาวรองพื้น: 18-30bp.

◆ เนื้อหา GC: 40-60%

◆ ค่า Tm: ซอฟต์แวร์ออกแบบไพรเมอร์ เช่น Primer 5 สามารถให้ค่า Tm ของไพรเมอร์ได้ค่า Tm ของไพรเมอร์อัพสตรีมและดาวน์สตรีมควรใกล้เคียงกันมากที่สุดนอกจากนี้ยังสามารถใช้สูตรการคำนวณ Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T)เมื่อดำเนินการ PCR โดยทั่วไปจะเลือกอุณหภูมิที่ต่ำกว่าค่าไพรเมอร์ Tm ที่ 5 °C เป็นอุณหภูมิการหลอม (การเพิ่มอุณหภูมิการหลอมที่สอดคล้องกันสามารถเพิ่มความจำเพาะของปฏิกิริยา PCR)

◆ ผลิตภัณฑ์รองพื้นและ PCR:

◆ ออกแบบไพรเมอร์ PCR ขยายความยาวของผลิตภัณฑ์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง 100-150bp

◆ ไพรเมอร์สำหรับการออกแบบในพื้นที่โครงสร้างทุติยภูมิของแม่แบบควรหลีกเลี่ยงให้มากที่สุด

หลีกเลี่ยงการก่อตัวของฐานเสริม 2 ฐานขึ้นไประหว่างปลาย 3′ ของไพรเมอร์ต้นน้ำและปลายน้ำ

◆ ฐานเทอร์มินัล Primer 3′ ไม่สามารถมี G หรือ C เพิ่มเติม 3 ตัวติดต่อกันได้

◆ ตัวไพรเมอร์เองไม่สามารถมีโครงสร้างเสริมกันได้ มิฉะนั้น จะเกิดโครงสร้างแบบกิ๊บ ซึ่งจะส่งผลต่อการขยาย PCR

◆ ควรกระจาย ATCG ให้เท่าๆ กันในลำดับไพรเมอร์ และควรหลีกเลี่ยงฐานเทอร์มินัล 3′ เป็น T

ภาคผนวก1：Cell โดยตรงRT-qPCR ชุดส่วนประกอบt แพ็คเสริม

1. โซลูชั่นสลายเซลล์