การฆ่าเชื้อปลายปิเปตและท่อ EP เป็นต้น

1. เตรียม DEPC (สารพิษสูง) 0.1% (หนึ่งในพัน) ด้วยน้ำปราศจากไอออน ใช้อย่างระมัดระวังในตู้ดูดควัน และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4°C ห่างจากแสง

น้ำ DEPC เป็นน้ำบริสุทธิ์ที่ผ่านการบำบัดด้วย DEPC และผ่านการฆ่าเชื้อด้วยอุณหภูมิสูงและความดันสูงผ่านการทดสอบว่าปราศจาก RNase, DNase และโปรติเนส

2. ใส่ปลายปิเปตและท่อ EP ลงใน DEPC 0.1% และตรวจสอบให้แน่ใจว่าปลายปิเปตและท่อ EP เต็มไปด้วย DEP 0.1%

3. ป้องกันแสง ปล่อยให้ค้างคืน (12-24 ชม.)

4. กล่องใส่ปลายและท่อ EP ไม่ต้องแช่ DEPCหลังจากนำน้ำ DEPC ออกจากปลายหรือท่อ EP อย่างคร่าวๆ แล้ว ให้บรรจุและห่อไว้

5. 121 องศาเซลเซียส 30 นาที

6. 180 องศาเซลเซียส แห้งหลายชั่วโมง (อย่างน้อย 3 ชั่วโมง)

หมายเหตุ:สวมถุงมือยางและหน้ากากเมื่อจัดการกับ DEPC!b หรือไม่มีการฆ่าเชื้อ DEPC, 130 ℃, หม้อนึ่งความดัน 90 นาที (ห้องปฏิบัติการหลายแห่งฆ่าเชื้อด้วยอุณหภูมิสูงสองครั้ง)

ข้อควรพิจารณาในการสกัด RNA

ปรากฏการณ์สำคัญสองประการของความล้มเหลวในการแยก RNA ของเนื้อเยื่อ

การสลายตัวของ RNA และการตกค้างของสิ่งสกปรกในเนื้อเยื่อเกี่ยวกับการย่อยสลาย ก่อนอื่นเรามาดูว่าเหตุใด RNA ที่สกัดจากเซลล์เพาะเลี้ยงจึงไม่ย่อยสลายได้ง่ายรีเอเจนต์การสกัด RNA ที่มีอยู่ทั้งหมดมีส่วนประกอบที่ยับยั้ง RNase อย่างรวดเร็วเพิ่ม lysate ลงในเซลล์เพาะเลี้ยง และเพียงแค่ผสม เซลล์ทั้งหมดสามารถผสมกับ lysate ได้อย่างทั่วถึง และเซลล์จะถูก lysed อย่างสมบูรณ์หลังจากที่เซลล์ถูกสลาย ส่วนผสมที่ออกฤทธิ์ในไลเสตจะยับยั้ง RNase ภายในเซลล์ทันที ดังนั้น RNA จึงยังคงอยู่กล่าวคือเนื่องจากเซลล์ที่เพาะเลี้ยงนั้นสัมผัสกับไลเซทได้ง่ายและเต็มที่ RNA ของพวกมันจึงไม่ถูกย่อยสลายโดยง่ายในทางกลับกัน RNA ในเนื้อเยื่อจะสลายตัวได้ง่ายเนื่องจากเซลล์ในเนื้อเยื่อไม่สามารถสัมผัสกับไลเซทได้อย่างรวดเร็วเนื่องจากมีการติดต่อพอสมควรดังนั้น,สมมติว่ามีวิธีเปลี่ยนเนื้อเยื่อให้เป็นเซลล์เดียวในขณะที่ยับยั้งการทำงานของ RNA ปัญหาการย่อยสลายก็จะสามารถแก้ไขได้อย่างสมบูรณ์

การกัดด้วยไนโตรเจนเหลวเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดอย่างไรก็ตาม วิธีการกัดด้วยไนโตรเจนเหลวนั้นลำบากมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อตัวอย่างมีจำนวนมากสิ่งนี้ก่อให้เกิดสิ่งที่ดีที่สุดถัดไป: โฮโมจิไนเซอร์เดอะโฮโมจิไนเซอร์วิธีการนี้ไม่ได้คำนึงถึงคำถามที่ว่ากิจกรรมของ RNase ถูกยับยั้งอย่างไรก่อนที่เซลล์จะถูกสัมผัสกับไลเซท แต่ขอให้อัตราการสลายตัวของเนื้อเยื่อเร็วกว่าอัตราที่ RNase ภายในเซลล์จะย่อยสลาย RN

ผลของโฮโมจีไนเซอร์ไฟฟ้าดีกว่าและผลกระทบของโฮโมจิไนเซอร์แก้วนั้นไม่ดี แต่โดยทั่วไปแล้ววิธีการโฮโมจิไนเซอร์ไม่สามารถป้องกันปรากฏการณ์การย่อยสลายได้ดังนั้น หากการสกัดลดลง ควรใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์ไฟฟ้าแบบเดิมสำหรับการบดด้วยไนโตรเจนเหลวควรเปลี่ยนโฮโมจิไนเซอร์แก้วเดิมเป็นโฮโมจิไนเซอร์ไฟฟ้าหรือบดโดยตรงด้วยไนโตรเจนเหลวปัญหาเป็นไปได้เกือบ 100%ได้รับการแก้ไข

ปัญหาสิ่งเจือปนตกค้างที่ส่งผลต่อการทดลองภายหลังมีสาเหตุที่หลากหลายมากกว่าการย่อยสลาย และวิธีแก้ไขก็แตกต่างกันตามลําดับสรุปแล้ว,หากมีการย่อยสลายหรือสิ่งสกปรกตกค้างในเนื้อเยื่อ จะต้องปรับวิธีการสกัด/รีเอเจนต์สำหรับวัสดุทดลองเฉพาะให้เหมาะสมที่สุดคุณไม่จำเป็นต้องใช้ตัวอย่างที่มีค่าของคุณสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพ: คุณสามารถซื้อสัตว์ขนาดเล็ก เช่น ปลา/ไก่ จากตลาด นำส่วนที่สอดคล้องกันของวัสดุสำหรับการสกัด RNA และส่วนอื่นๆ สำหรับการสกัดโปรตีน – บดด้วยสารสกัดจากปาก กระเพาะ และลำไส้

RNA เป้าหมายของ RNA ที่แยกออกมาใช้สำหรับการทดลองติดตามผลที่แตกต่างกัน และข้อกำหนดด้านคุณภาพก็แตกต่างกัน

การสร้างไลบรารี cDNA ต้องการความสมบูรณ์ของ RNA โดยไม่มีสารยับยั้งปฏิกิริยาของเอนไซม์ตกค้างภาคเหนือต้องการความสมบูรณ์ของ RNA ที่สูงขึ้นและความต้องการที่ต่ำกว่าสำหรับสารยับยั้งปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ตกค้างRT-PCR ไม่ต้องการความสมบูรณ์ของ RNA ที่สูงเกินไปแต่ยับยั้งปฏิกิริยาของเอ็นไซม์ข้อกำหนดเกี่ยวกับสารตกค้างนั้นเข้มงวดอินพุตกำหนดเอาต์พุตทุกครั้งที่มีเป้าหมายเพื่อให้ได้ RNA ที่มีความบริสุทธิ์สูงสุด จะต้องเสียค่าใช้จ่ายทั้งคนและเงิน

การเก็บ/จัดเก็บตัวอย่าง

ปัจจัยที่มีผลต่อการย่อยสลาย หลังจากที่ตัวอย่างออกจากร่างกายที่มีชีวิต/หรือสภาพแวดล้อมการเจริญเติบโตดั้งเดิม เอ็นไซม์ภายนอกในตัวอย่างจะเริ่มย่อยสลาย RNAและอัตราการย่อยสลายมีความสัมพันธ์กับเนื้อหาของเอนไซม์ภายในร่างกายและอุณหภูมิตามเนื้อผ้า มีเพียงสองวิธีที่จะยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ภายในอย่างสมบูรณ์: เพิ่ม lysate ทันทีและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างทั่วถึงและรวดเร็ว;ตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ แล้วแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันทีทั้งสองวิธีต้องการการดำเนินการที่รวดเร็วแบบหลังเหมาะสำหรับทุกตัวอย่าง ในขณะที่แบบแรกเหมาะสำหรับเนื้อเยื่อที่มีปริมาณเซลล์และเอ็นไซม์ภายนอกต่ำเท่านั้น และง่ายต่อการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยเฉพาะอย่างยิ่ง เนื้อเยื่อพืช ตับ ต่อมไทมัส ตับอ่อน ม้าม สมอง ไขมัน เนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อ ฯลฯ ควรแช่แข็งด้วยไนโตรเจนเหลวก่อนดำเนินการ

การแยกส่วนและการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของตัวอย่าง

ปัจจัยที่มีผลต่อการย่อยสลายและผลผลิต การกระจายตัวของตัวอย่างคือเพื่อให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างทั่วถึงซึ่งมีไว้สำหรับการปลดปล่อย RNA ที่สมบูรณ์และสมบูรณ์เซลล์สามารถทำให้เป็นเนื้อเดียวกันได้โดยตรงโดยไม่แตกเนื้อเยื่อสามารถทำให้เป็นเนื้อเดียวกันได้หลังจากหักเท่านั้นยีสต์และแบคทีเรียจำเป็นต้องแตกตัวด้วยเอนไซม์ที่สอดคล้องกันก่อนที่จะสามารถทำให้เป็นเนื้อเดียวกันได้เนื้อเยื่อที่มีปริมาณเอ็นไซม์ภายนอกต่ำและการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันง่ายขึ้นสามารถบดและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในครั้งเดียวในไลเซทโดยโฮโมจีไนเซอร์เนื้อเยื่อพืช ตับ ต่อมไทมัส ตับอ่อน ม้าม สมอง ไขมัน เนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อ และตัวอย่างอื่นๆ พวกมันมีเอนไซม์ภายในร่างกายสูงหรือไม่สามารถทำให้เป็นเนื้อเดียวกันได้ง่ายดังนั้นการหยุดชะงักของเนื้อเยื่อและการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันจึงต้องแยกจากกัน.วิธีการแยกส่วนที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพมากที่สุดคือการกัดด้วยไนโตรเจนเหลว และวิธีที่เชื่อถือได้มากที่สุดในการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันคือการใช้เครื่องทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยไฟฟ้าหมายเหตุพิเศษเกี่ยวกับการกัดด้วยไนโตรเจนเหลว: ต้องไม่ละลายตัวอย่างในระหว่างกระบวนการกัดทั้งหมด เนื่องจากเอ็นไซม์ภายนอกมีแนวโน้มที่จะทำงานเมื่อถูกแช่แข็ง

ทางเลือกของไลเซท

ส่งผลต่อความสะดวกในการดำเนินการและปัจจัยของสิ่งเจือปนภายนอกที่ตกค้าง สารละลายสลายที่ใช้กันทั่วไปสามารถยับยั้งการทำงานของ RNase ได้เกือบทั้งหมดดังนั้น ประเด็นสำคัญในการเลือกสารละลายไลซิสคือการพิจารณาร่วมกับวิธีการทำให้บริสุทธิ์มีข้อยกเว้นประการหนึ่งคือตัวอย่างที่มีปริมาณเอนไซม์ภายในร่างกายสูงแนะนำให้ใช้ไลเสตที่มีฟีนอลเพื่อเพิ่มความสามารถในการยับยั้งเอนไซม์ภายในร่างกาย

การเลือกวิธีการทำให้บริสุทธิ์

ปัจจัยที่ส่งผลต่อสิ่งเจือปนภายนอกที่ตกค้าง ความเร็วในการสกัด สำหรับตัวอย่างที่สะอาด เช่น เซลล์ สามารถรับผลลัพธ์ที่น่าพอใจได้ด้วยวิธีการทำให้บริสุทธิ์เกือบทุกวิธีแต่สำหรับตัวอย่างอื่นๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งตัวอย่างที่มีสิ่งสกปรกในระดับสูง เช่น พืช ตับ แบคทีเรีย ฯลฯ การเลือกวิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญวิธีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์แบบแรงเหวี่ยงมีความเร็วในการสกัดที่รวดเร็วและสามารถขจัดสิ่งเจือปนที่ส่งผลต่อปฏิกิริยาของเอ็นไซม์ของ RNA ที่ตามมาได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่มีราคาแพง (Foregene สามารถเสนอชุดอุปกรณ์ที่คุ้มค่า รายละเอียดเพิ่มเติมคลิกที่นี่);การใช้วิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่ประหยัดและคลาสสิก เช่น การตกตะกอนของ LiCl ยังสามารถได้รับผลลัพธ์ที่น่าพอใจ แต่เวลาในการดำเนินการนั้นยาวนาน.

“สามวินัยและแปดความสนใจ” สำหรับการสกัด RNA

วินัย 1:ยุติการปนเปื้อนของเอนไซม์ภายนอก

หมายเหตุ 1:สวมหน้ากากอนามัยและถุงมืออย่างเคร่งครัด

โน้ต 2:ควรกำจัดหลอด centrifuge หัวทิป แท่งปิเปต ถังอิเล็กโตรโฟรีซิส และม้านั่งทดลองที่เกี่ยวข้องกับการทดลองอย่างทั่วถึง

หมายเหตุ 3:รีเอเจนต์/สารละลายที่เกี่ยวข้องในการทดลอง โดยเฉพาะน้ำ ต้องปราศจาก RNase

วินัย 2:ขัดขวางการทำงานของเอ็นไซม์ภายนอก

หมายเหตุ 4:เลือกวิธีการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันที่เหมาะสม

หมายเหตุ 5:เลือกไลเซทที่เหมาะสม

หมายเหตุ 6:ควบคุมปริมาณเริ่มต้นของตัวอย่าง

วินัย 3:ชี้แจงวัตถุประสงค์ในการสกัดของคุณ

หมายเหตุ 7:เมื่อระบบไลเซทใดๆ เข้าใกล้จำนวนตัวอย่างเริ่มต้นสูงสุด อัตราความสำเร็จในการสกัดจะลดลงอย่างรวดเร็ว

หมายเหตุ 8:เกณฑ์ทางเศรษฐกิจเพียงอย่างเดียวสำหรับการสกัด RNA ที่ประสบความสำเร็จคือความสำเร็จในการทดลองครั้งต่อๆ ไป ไม่ใช่ผลลัพธ์

แหล่งที่มา 10 อันดับแรกของการปนเปื้อน RNase

1. นิ้วมือเป็นแหล่งแรกของเอนไซม์จากภายนอก จึงต้องสวมและเปลี่ยนถุงมือบ่อยๆนอกจากนี้ต้องสวมหน้ากากอนามัยด้วย เพราะการหายใจก็เป็นแหล่งสำคัญของเอนไซม์เช่นกันประโยชน์เพิ่มเติมของการสวมหน้ากากถุงมือคือการปกป้องผู้ทำการทดลอง

2. ทิปปิเปต, หลอดปั่นแยก, ปิเปต – RNase ไม่สามารถปิดการใช้งานได้โดยการฆ่าเชื้อเพียงอย่างเดียว ดังนั้น ทิปปิเปตและหลอดปั่นแยกควรได้รับการบำบัดด้วย DEPC แม้ว่าจะถูกทำเครื่องหมายว่าผ่านการบำบัดด้วย DEPC ก็ตามทางที่ดีควรใช้ปิเปตสำหรับวัตถุประสงค์พิเศษ เช็ดด้วยสำลีก้อนที่มีแอลกอฮอล์ 75% ก่อนใช้งาน โดยเฉพาะก้านสูบนอกจากนี้ อย่าใช้น้ำยาล้างหัว

3. น้ำ/บัฟเฟอร์ต้องปราศจากการปนเปื้อนของ RNase

4. ควรเช็ดโต๊ะทดสอบอย่างน้อยด้วยสำลีแอลกอฮอล์ 75%

5.RNase ภายในร่างกาย เนื้อเยื่อทั้งหมดมีเอนไซม์ภายในร่างกาย ดังนั้น การแช่แข็งเนื้อเยื่ออย่างรวดเร็วด้วยไนโตรเจนเหลวเป็นวิธีที่ดีที่สุดในการลดการย่อยสลายวิธีการเก็บ/บดไนโตรเจนเหลวนั้นไม่สะดวกอย่างแน่นอน แต่เป็นวิธีเดียวสำหรับเนื้อเยื่อที่มีเอนไซม์ภายในระดับสูง

6. ตัวอย่าง RNA ผลิตภัณฑ์สกัด RNA อาจมีร่องรอยของการปนเปื้อนของ RNase

7. การสกัดพลาสมิดมักใช้ Rnase เพื่อย่อยสลาย RNA และ Rnase ที่เหลือควรถูกย่อยด้วยโปรตีเนส K และสกัดโดย PCI

8. การเก็บรักษา RNA แม้ว่าจะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิต่ำ ปริมาณ RNase ที่ติดตามจะทำให้ RNA เสื่อมสภาพทางออกที่ดีที่สุดสำหรับการเก็บรักษา RNA ในระยะยาวคือการแขวนตะกอนเกลือ/แอลกอฮอล์ เนื่องจากแอลกอฮอล์จะยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ทั้งหมดที่อุณหภูมิต่ำ

9. เมื่อไอออนบวก (Ca, Mg) มีไอออนเหล่านี้ การให้ความร้อนที่ 80C เป็นเวลา 5 นาทีจะทำให้ RNA ขาด ดังนั้นหาก RNA จำเป็นต้องได้รับความร้อน สารละลายถนอมอาหารจะต้องมีสารคีเลต (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)

10. เอนไซม์ที่ใช้ในการทดลองครั้งต่อไปอาจปนเปื้อนด้วย RNase

10 เคล็ดลับสำหรับการสกัด RNA

1: ป้องกันกิจกรรม RNase อย่างรวดเร็วตัวอย่างจะถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วหลังการเก็บ และ RNase จะถูกปิดใช้งานโดยการทำงานอย่างรวดเร็วระหว่างการสลาย

2: เลือกวิธีการสกัดที่เหมาะสมสำหรับเนื้อเยื่อที่มีปริมาณไรโบไซม์สูง และเนื้อเยื่อไขมันควรใช้วิธีการที่มีฟีนอล

3: คุณภาพการทำนายต้องการภาคเหนือ การสร้างไลบรารี cDNA ต้องมีความสมบูรณ์สูง และ RT-PCR และ RPA (การทดสอบการป้องกันไรโบนิวคลีเอส) ไม่ต้องการความสมบูรณ์สูงRT-PCR ต้องการความบริสุทธิ์สูง (สารยับยั้งเอนไซม์ตกค้าง)

4: การทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างทั่วถึงเป็นกุญแจสำคัญในการปรับปรุงผลผลิตและลดการย่อยสลาย

5: ตรวจสอบความสมบูรณ์ของการตรวจจับ RNA อิเล็กโตรโฟรีซิส 28S: 18S = 2: 1 เป็นสัญญาณที่สมบูรณ์ 1: 1 เป็นที่ยอมรับสำหรับการทดลองส่วนใหญ่

6: การกำจัด DNA สำหรับ RT-PCR, การวิเคราะห์อาร์เรย์ เป็นการดีที่สุดที่จะใช้ Dnase I เพื่อลบ DNA

7: ลดการปนเปื้อนของเอ็นไซม์จากภายนอก – เอ็นไซม์ไม่สามารถนำเข้าจากภายนอกได้

8: เมื่อทำให้กรดนิวคลีอิกความเข้มข้นต่ำเข้มข้น ควรเติมสารทำปฏิกิริยาตกตะกอนร่วมแต่เพื่อป้องกันการตกตะกอนร่วมที่มีเอนไซม์และดีเอ็นเอปนเปื้อน

9: ละลาย RNA อย่างทั่วถึง ถ้าจำเป็น ให้ความร้อนที่ 65C เป็นเวลา 5 นาที

วิธีการจัดเก็บที่เหมาะสม

สามารถเก็บไว้ที่ –20C ในช่วงเวลาสั้นๆ และที่ –80C เป็นเวลานานขั้นตอนแรกในการปรับปรุงผลผลิต RNA คือการตระหนักว่าเนื้อหา RNA ของตัวอย่างที่แตกต่างกันนั้นแตกต่างกันอย่างมากปริมาณมาก (2-4 มก./มก.) เช่น ตับ ตับอ่อน หัวใจ ปริมาณปานกลาง (0.05-2 มก./มก.) เช่น สมอง เอ็มบริโอ ไต ปอด ต่อมไทมัส รังไข่ ปริมาณน้อย (<0.05 มก./มก.) เช่น กระเพาะปัสสาวะ กระดูก ไขมัน

1: ไลส์เซลล์เพื่อปลดปล่อย RN – หากไม่ปล่อย RNA ผลผลิตจะลดลงการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยไฟฟ้าทำงานได้ดีกว่าวิธีทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอื่นๆ แต่อาจต้องใช้ร่วมกับวิธีอื่นด้วย เช่น การบดด้วยไนโตรเจนเหลว การย่อยด้วยเอนไซม์ (Lysozyme/Lyticase)

2: การเพิ่มประสิทธิภาพของวิธีการสกัดปัญหาที่ใหญ่ที่สุดของวิธีการที่ใช้ฟีนอลคือการแบ่งชั้นที่ไม่สมบูรณ์และการสูญเสีย RNA บางส่วน (ไม่สามารถกำจัดส่วนที่เกินออกได้ทั้งหมด)การแบ่งชั้นที่ไม่สมบูรณ์เกิดจากปริมาณกรดนิวคลีอิกและโปรตีนสูง ซึ่งสามารถแก้ไขได้โดยการเพิ่มปริมาณไลเซทที่ใช้หรือลดปริมาณตัวอย่างเพิ่มขั้นตอนการสกัดคลอโรฟอร์มลงในเนื้อเยื่อไขมันการสูญเสีย RNA สามารถลดลงได้โดยการสูบกลับหรือโดยการเอาชั้นสารอินทรีย์ออกตามด้วยการปั่นแยกปัญหาที่ใหญ่ที่สุดของวิธีการหมุนเหวี่ยงด้วยคอลัมน์คือตัวอย่างที่มากเกินไป

เคล็ดลับการสกัดแบบคลาสสิก

1. การทำฟีนอลให้บริสุทธิ์: เติมฟีนอล/คลอโรฟอร์มในอัตราส่วน 1:1 เท่ากัน แล้วผสมแรงๆ เป็นเวลา 1-2 นาทีหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วสูงเป็นเวลา 2 นาทีนำส่วนเหนือตะกอนออกอย่างระมัดระวัง (80-90%)ไม่เคยไปถึงชั้นกลางปริมาตรที่เท่ากันของสารละลายปฏิกิริยาสามารถเติมลงในฟีนอล/คลอโรฟอร์มและกำจัดส่วนที่เกินออกได้ส่วนเหนือตะกอนทั้งสองสามารถผสมเข้าด้วยกันสำหรับการตกตะกอนของกรดนิวคลีอิกเพื่อปรับปรุงผลผลิตอย่าผสมอย่างเบามือเกินไป และอย่าพยายามเอาส่วนเกินออกทั้งหมด

2. การล้างด้วยเอทานอล 70-80%: ระหว่างการซัก กรดนิวคลีอิกต้องถูกระงับเพื่อให้แน่ใจว่าเกลือที่ตกค้างถูกชะล้างออกไปในเวลาเดียวกัน ทันทีที่เทเอทานอลออก ให้หมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วสูงเป็นเวลาสองสามวินาที แล้วนำเอทานอลที่ตกค้างออกด้วยปิเปตละลายหลังจากยืนอยู่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5-10 นาที

11. การแยกองค์กรพิเศษ

1. เนื้อเยื่อเส้นใย: กุญแจสำคัญในการสกัด RNA จากเนื้อเยื่อเส้นใย เช่น หัวใจ/กล้ามเนื้อโครงร่าง คือการทำให้เนื้อเยื่อแตกสลายอย่างสมบูรณ์เนื้อเยื่อเหล่านี้มีความหนาแน่นของเซลล์ต่ำ ดังนั้นปริมาณ RNA ต่อหน่วยน้ำหนักของเนื้อเยื่อจึงต่ำ และควรใช้ในปริมาณเริ่มต้นมากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้อย่าลืมบดเนื้อเยื่อให้ละเอียดภายใต้สภาวะการแช่แข็ง

2. เนื้อเยื่อที่มีปริมาณโปรตีน/ไขมันสูง: สมอง/ผักมีปริมาณไขมันสูงหลังจากการสกัด PCI แล้ว ส่วนเหนือตะกอนจะมีก้อนสีขาวส่วนเหนือตะกอนจะต้องถูกแยกออกอีกครั้งด้วยคลอโรฟอร์ม

3. เนื้อเยื่อที่มีปริมาณกรดนิวคลีอิก/ไรโบไซม์สูง: ม้าม/ไทมัสมีกรดนิวคลีอิกและไรโบไซม์สูงการบดเนื้อเยื่อภายใต้สภาวะเยือกแข็งตามด้วยการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างรวดเร็วสามารถยับยั้งไรโบไซม์ได้อย่างมีประสิทธิภาพอย่างไรก็ตาม หากไลเซทมีความหนืดเกินไป (เนื่องจากมีปริมาณกรดนิวคลีอิกสูง) การสกัด PCI จะไม่สามารถแบ่งชั้นได้อย่างมีประสิทธิภาพการเพิ่ม lysate สามารถแก้ไขปัญหานี้ได้การสกัด PCI หลายครั้งสามารถกำจัด DNA ที่ตกค้างได้มากขึ้นหากเกิดตะกอนสีขาวทันทีหลังจากเติมแอลกอฮอล์ แสดงว่ามีการปนเปื้อนของ DNAการสกัดซ้ำด้วย PCI ที่เป็นกรดหลังจากการละลายสามารถกำจัดการปนเปื้อนของ DNA ได้

4. เนื้อเยื่อพืช: เนื้อเยื่อพืชมีความซับซ้อนมากกว่าเนื้อเยื่อสัตว์โดยทั่วไป พืชจะถูกบดภายใต้สภาวะไนโตรเจนเหลว ดังนั้นการย่อยสลาย RNA โดยเอนไซม์ภายในร่างกายจึงไม่ใช่เรื่องปกติหากปัญหาการย่อยสลายไม่ได้รับการแก้ไข แสดงว่าเกือบจะเกิดจากสิ่งเจือปนในตัวอย่างสิ่งเจือปนที่มีอยู่ในพืชหลายชนิดจะทำให้เกิดสารตกค้าง และสาเหตุของสารตกค้างมักเป็นเพราะสิ่งเจือปนเหล่านี้มีความคล้ายคลึงกันบางอย่างกับ RNA: คุณตกตะกอนและฉันตกตะกอน และคุณดูดซับและฉันดูดซับลักษณะเหล่านี้เป็นตัวกำหนดว่าพวกมันเป็นตัวยับยั้งเอนไซม์ที่แรงมาก

ในปัจจุบัน รีเอเจนต์การสกัด RNA เชิงพาณิชย์สามารถปรับให้เข้ากับเนื้อเยื่อสัตว์เกือบทั้งหมดได้ด้วยการปรับแต่งเล็กน้อย แต่มีรีเอเจนต์การสกัด RNA เชิงพาณิชย์ไม่กี่ตัวที่เหมาะกับเนื้อเยื่อพืชส่วนใหญ่โชคดีที่ Foregene สามารถมอบสิ่งพิเศษได้ชุดสกัด RNA ของพืช, เรามีชุดแยก RNA ของพืชทั้งหมด, ชุดแยก RNA ของพืชรวม.ได้รับการออกแบบมาเป็นพิเศษสำหรับพืชที่มีปริมาณโพลีแซคคาไรด์และโพลีฟีนอลสูงสำหรับการสกัด RNA ข้อเสนอแนะจากผู้ใช้ห้องปฏิบัติการนั้นดีมาก

12. ผลของการแช่แข็งและการละลายตัวอย่าง ตัวอย่างแช่แข็งอาจมีขนาดใหญ่ขึ้น และจำเป็นต้องตัดออกก่อนนำไปใช้ในการสกัด RNAตัวอย่างมีแนวโน้มที่จะละลาย (อาจบางส่วน) ระหว่างการตัดอาจต้องชั่งน้ำหนักตัวอย่างที่แช่แข็งก่อนการสกัด RNA และการละลายจะเกิดขึ้นอย่างแน่นอนในระหว่างกระบวนการนี้บางครั้ง การละลายของตัวอย่างยังเกิดขึ้นระหว่างกระบวนการกัดไนโตรเจนเหลวหรือตัวอย่างที่แช่แข็งจะถูกเติมลงในไลเซทโดยตรงโดยไม่ต้องกัดไนโตรเจนเหลว และการละลายจะเกิดขึ้นอย่างแน่นอนก่อนที่จะทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างสมบูรณ์การทดลองแสดงให้เห็นว่าเนื้อเยื่อที่แช่แข็งมีแนวโน้มที่จะสลายตัวของ RNA ระหว่างการละลายมากกว่าเนื้อเยื่อสดสาเหตุที่เป็นไปได้: กระบวนการละลายน้ำแข็งทำลายโครงสร้างภายในเซลล์ ทำให้เอ็นไซม์ภายนอกเข้ามาสัมผัสโดยตรงกับ RNA ได้ง่ายขึ้น

13. การตัดสินคุณภาพของ RNA โดยปกติแล้ว อิเล็กโตรโฟรีซิสจะใช้เพื่อตัดสินความสมบูรณ์ของ RNA และ A260/A280 ใช้ในการตัดสินความบริสุทธิ์ของ RNAตามทฤษฎีแล้ว RNA ที่ไม่บุบสลายมีอัตราส่วน 28S:18S = 2.7:1 และข้อมูลส่วนใหญ่เน้นย้ำอัตราส่วน 28S:18S = 2:1ความจริงก็คือแทบไม่มี RNA ที่สกัดจากตัวอย่างอื่นนอกจากเซลล์เลยในอัตราส่วน 2:1 (ซึ่งได้มาจาก Agilent Bioanalyzer)

ผลลัพธ์อิเล็กโทรโฟรีซิสของ RNA ได้รับผลกระทบจากหลายปัจจัย รวมถึงโครงสร้างทุติยภูมิ สภาวะอิเล็กโทรโฟรีซิส โหลดตัวอย่าง ระดับความอิ่มตัวของ EB เป็นต้น ใช้อิเล็กโทรโฟเรซิสดั้งเดิมเพื่อตรวจจับ RNA และใช้ DNA Marker เป็นตัวควบคุมหาก 28S ที่ 2kb และ 18S ที่ 0.9kb มีความชัดเจน และ 28S: 18S > 1 ความสมบูรณ์จะเป็นไปตามข้อกำหนดของการทดลองที่ตามมาส่วนใหญ่

A260/A280 เป็นตัวบ่งชี้ที่ทำให้เกิดความสับสนอย่างมากก่อนอื่น จำเป็นต้องชี้แจงความหมายดั้งเดิมของตัวบ่งชี้นี้สำหรับกรดนิวคลีอิก: RNA บริสุทธิ์, A260/280 = ประมาณ 2.0Pure RNA คือ 'สาเหตุ' และ A260/A280 = 2 คือ 'ผล'ตอนนี้ทุกคนใช้ A260/A280 เป็น 'สาเหตุ' โดยคิดว่า "ถ้า A260/A280 = 2 แสดงว่า RNA นั้นบริสุทธิ์" ซึ่งทำให้เกิดความสับสนโดยธรรมชาติ

หากคุณสนใจ คุณสามารถเพิ่มรีเอเจนต์เล็กน้อยที่มักใช้ในการสกัด เช่น ฟีนอล กัวนิดีน ไอโซไทโอไซยาเนต PEG ฯลฯ ลงในตัวอย่าง RNA ของคุณ แล้ววัดอัตราส่วน A260/A280ความจริงก็คือรีเอเจนต์จำนวนมากที่ใช้ในการสกัด RNA รวมถึงสิ่งเจือปนจำนวนมากในตัวอย่าง ดูดซับรอบๆ A260 และ A280 ซึ่งส่งผลต่อ A260/A280

วิธีการแนะนำมากที่สุดในปัจจุบันคือการสแกนตัวอย่าง RNA ในช่วง 200-300 นาโนเมตรเส้นโค้งของ RNA บริสุทธิ์มีลักษณะดังนี้: เส้นโค้งเรียบ A230 และ A260 เป็นจุดเปลี่ยนสองจุด A300 ใกล้กับ 0 A260/A280 = ประมาณ 2.0 และ A260/A230 = ประมาณ 2.0หากไม่มีข้อมูลการสแกน จะต้องกำหนดอัตราส่วน A260/A230 ด้วย เนื่องจากอัตราส่วนนี้มีความไวต่อสิ่งเจือปนทั้งหมดที่ส่งผลต่อปฏิกิริยาของเอนไซม์มากกว่าคำนึงถึงช่วงเชิงเส้นของอุปกรณ์ (0.1–0.5 สำหรับ A260)

มีปรากฏการณ์ที่เป็นประโยชน์อีกสองประการ: อัตราส่วนจะลดลงประมาณ 0.3 เมื่อวัด A260/A280 ในน้ำ;ในขณะที่อัตราส่วนที่วัดได้ใน 10 mM EDTA นั้นสูงกว่าที่วัดใน 1 mM EDTA ประมาณ 0.2

สินค้าที่เกี่ยวข้อง:

ผู้ผลิตและผู้จัดจำหน่ายชุดแยก RNA ของโรงงานในจีน |Foregene (foreivd.com)

ซัพพลายเออร์และโรงงานชุดแยก RNA |ผู้ผลิตชุดแยก RNA ของจีน (foreivd.com)

ชุดแยก RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)