การทดลอง RT-qPCR ประกอบด้วยการสกัด RNA และการประเมินคุณภาพ การถอดความแบบย้อนกลับ และ qPCR สามขั้นตอน แต่ละขั้นตอนมีข้อควรระวังมากมาย เราจะแนะนำในรายละเอียดด้านล่าง

Ⅰ.การประเมินคุณภาพ RNA

ในการทดลอง RT-qPCR หลังจากการสกัด RNA เสร็จสิ้น คุณภาพของ RNA จำเป็นต้องได้รับการประเมิน และการทดลองติดตามผลจะดำเนินการได้หลังจากผ่านการรับรองแล้วเท่านั้นวิธีการประเมินประกอบด้วยสเปกโตรโฟโตมิเตอร์, Agilent gel electrophoresis, การวิเคราะห์ Agilent 2100 ซึ่งในบรรดาวิธีการตรวจด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์และวิธีการ agarose gel electrophoresis ที่ใช้บ่อยที่สุดควรสังเกตว่าจำเป็นต้องใช้สองวิธีนี้ร่วมกันเพื่อทำการตรวจจับและวิเคราะห์ความเข้มข้น ความบริสุทธิ์ และความสมบูรณ์ของ RNA เพื่อให้มั่นใจในคุณภาพของ RNA

ชุดแยก RNA ที่เกี่ยวข้อง: 

ชุดแยก RNA ของเซลล์ทั้งหมด

สามารถรับ RNA ทั้งหมดที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์และมีคุณภาพสูงได้จากเซลล์เพาะเลี้ยงต่างๆ ใน ​​11 นาที

ชุดแยก RNA ของสัตว์ทั้งหมด

สกัด RNA ทั้งหมดที่มีความบริสุทธิ์สูงและมีคุณภาพสูงอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพจากเนื้อเยื่อสัตว์ต่างๆ

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์:

เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ส่วนใหญ่จะใช้เพื่อกำหนดความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของ RNA แต่ไม่สามารถตรวจจับความสมบูรณ์ของ RNA และสารตกค้างในจีโนมได้ในหมู่พวกเขา A260/280 และ A260/230 เป็นพารามิเตอร์ที่สำคัญสำหรับการตรวจจับความบริสุทธิ์ของ RNA และสามารถตรวจจับความบริสุทธิ์ของ RNA ได้ตามความผันผวนของค่า:

1. 1.9< A260/280< 2.1 แสดงว่า RNA บริสุทธิ์ดี;A260/280<1.9 แสดงว่าอาจมีโปรตีนตกค้างใน RNA;A260/280>2.1 ซึ่งบ่งชี้ถึงการย่อยสลายบางส่วนของ RNA ที่เป็นไปได้ ซึ่งสามารถยืนยันเพิ่มเติมได้โดย agarose gel electrophoresis

2. 2.0< A260/230< 2.2 แสดงว่า RNA บริสุทธิ์ดี;A260/230 < 2.0 แสดงว่าอาจมีสารรีเอเจนต์อินทรีย์ตกค้างใน RNA เช่น ฟีนอล เอทานอล หรือน้ำตาล

Agarose gel อิเล็กโตรโฟรีซิส:

การทดสอบ Agarose gel electrophoresis สามารถวิเคราะห์ความสมบูรณ์ของ RNA, จีโนมและโปรตีนตกค้าง แต่ไม่สามารถวัดความเข้มข้นของ RNA หรือตรวจจับสารรีเอเจนต์อินทรีย์ที่ตกค้างได้อย่างแม่นยำใช้เทมเพลต RNA ของยูคาริโอต เช่น:

1. RNA อยู่ภายใต้ agarose gel electrophoresisหากมีเพียงสามแถบเดียวของ 28sRNA, 18sRNA และ 5.8sRNA บนแผนที่เจล แสดงว่า RNA ที่แยกออกมานั้นไม่เสียหายหากมีปรากฏการณ์การลาก แสดงว่า RNA บางส่วนเสื่อมสภาพ

2. หากมีแถบสว่างเพียงแถบเดียวระหว่างรูกาวและแถบ 28sRNA อาจมี DNA ของจีโนมตกค้างอยู่

3. หากมีแถบปรากฏขึ้นในรูกาว แสดงว่าอาจมีโปรตีนและสารโมเลกุลขนาดใหญ่อื่นๆ หลงเหลืออยู่

Ⅱ. การถอดความแบบย้อนกลับ

หลังจากการสกัด RNA เสร็จสิ้น จำเป็นต้องแปลงกลับเป็น cDNA สำหรับการทดลองครั้งต่อๆ ไป ดังนั้นขั้นตอนการกลับรายการจึงมีความสำคัญการถอดรหัสย้อนกลับจะถูกนำมาใช้จากการเลือกย้อนกลับของทรานสคริปเทสและไพรเมอร์:

การเลือกทรานสคริปเทสแบบย้อนกลับ:

การถอดรหัสแบบย้อนกลับโดยทั่วไปประกอบด้วย AMV RTase และ MMLV RTaseRNase H ของ AMV RTase มีฤทธิ์แรง ระยะเวลาการสังเคราะห์สั้น ปริมาณการสังเคราะห์ต่ำ และเสถียรภาพทางความร้อนที่ดี (42 ~ 55℃)กิจกรรม RNase H ของ MMLV RTase อ่อนแอ ระยะเวลาการสังเคราะห์ยาว ปริมาณการสังเคราะห์สูง และความเสถียรทางความร้อนไม่ดี (37 ~ 42 ℃)

เนื่องจากเอนไซม์ RNase H มีหน้าที่ในการย่อยสลายแม่แบบ RNA ดังนั้นควรเลือก MMLV ที่มีกิจกรรม RNase H ที่อ่อนแอเป็นพิเศษในระหว่างการถอดความแบบย้อนกลับ และหลังจากพันธุวิศวกรรมในภายหลัง ความคงตัวทางความร้อนของ MMLV ได้ก้าวกระโดดในเชิงคุณภาพรับ ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV สำหรับการถอดความแบบย้อนกลับ) ตัวอย่างเช่น เป็นเอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเทสตัวใหม่ที่แสดงออกในแบคทีเรียที่ดัดแปลงพันธุกรรม E. coli โดยใช้เทคโนโลยีการรวมตัวกันอีกครั้งทางพันธุกรรมเป็นรีคอมบิแนนต์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ที่สังเคราะห์สายดีเอ็นเอเสริมจากอาร์เอ็นเอสายเดี่ยว ดีเอ็นเอ หรืออาร์เอ็นเอ:ดีเอ็นเอลูกผสมไม่มีกิจกรรม RNase H ความเสถียรที่แข็งแกร่ง ความสัมพันธ์ RNA ที่แข็งแกร่ง และความไวในการตรวจจับสูง

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV สำหรับการถอดความแบบย้อนกลับ)

การเลือกสีรองพื้น:

โดยทั่วไปไพรเมอร์ RT แบ่งออกเป็นสามประเภท: โอลิโก ดีที ไพรเมอร์แบบสุ่ม และไพรเมอร์เฉพาะยีนเลือกไพรเมอร์ที่เหมาะสมสำหรับใช้ตามความต้องการในการทดลองที่แตกต่างกัน

1. หากเทมเพลตมาจากต้นกำเนิดยูคาริโอตและใช้ cDNA ตอนปลายสำหรับการขยาย PCR ตามปกติ ขอแนะนำให้ใช้ Oligo (dT)ถ้าการทดลองครั้งต่อไปใช้สำหรับ qPCR เท่านั้น ขอแนะนำให้ใช้ Oligo (dT) ผสมกับไพรเมอร์แบบสุ่มเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพของการถอดความแบบย้อนกลับ

2. หากแม่แบบมาจากโปรคารีโอต ควรเลือกไพรเมอร์แบบสุ่มหรือไพรเมอร์เฉพาะของยีนสำหรับการถอดความแบบย้อนกลับ

Ⅲ.คิวพีซีอาร์

การหาปริมาณของฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่มีรายละเอียดตั้งแต่การเลือกวิธีการเชิงปริมาณ หลักการออกแบบไพรเมอร์ การเลือก ROX การกำหนดค่าระบบปฏิกิริยา และการตั้งค่าสภาวะของปฏิกิริยา เป็นต้น

การเลือกวิธีการเชิงปริมาณ:

วิธีการเชิงปริมาณแบ่งออกเป็นวิธีการเชิงปริมาณสัมพัทธ์และวิธีการเชิงปริมาณสัมบูรณ์ปริมาณสัมพัทธ์สามารถใช้เพื่อตรวจหาผลของวิธีการรักษาบางอย่างต่อการแสดงออกของยีน ตรวจหาความแตกต่างของการแสดงออกของยีนในเวลาต่างๆ และเปรียบเทียบความแตกต่างของการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อต่างๆการหาปริมาณแบบสัมบูรณ์สามารถตรวจจับปริมาณกรดนิวคลีอิกในไวรัสและอื่นๆเมื่อทำการทดลอง เราต้องเลือกวิธีการเชิงปริมาณที่เหมาะสมตามการทดลองของเราเอง

หลักการออกแบบรองพื้น:

การออกแบบไพรเมอร์สำหรับ qPCR เกี่ยวข้องโดยตรงกับประสิทธิภาพการขยายสัญญาณและความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ดังนั้น การออกแบบไพรเมอร์ที่ดีอย่างถูกต้องจึงเป็นขั้นตอนแรกของ qPCR ที่ประสบความสำเร็จในการออกแบบสีรองพื้น ควรคำนึงถึงหลักการต่อไปนี้เมื่อเป็นไปตามหลักการออกแบบสีรองพื้นทั่วไป:

1. ความยาวของชิ้นส่วนเป้าหมายถูกควบคุมระหว่าง 100 และ 300 bp

2. การออกแบบ cross-exon เพื่อหลีกเลี่ยงอิทธิพลของ DNA จีโนม

3. ไพรเมอร์ที่ออกแบบจำเป็นต้องได้รับการทดสอบประสิทธิภาพการขยาย และเฉพาะเมื่อประสิทธิภาพการขยายถึงมาตรฐาน (90-110%) เท่านั้นที่สามารถใช้สำหรับการทดลองเชิงปริมาณ

4. ความเข้มข้นของไพรเมอร์มักจะปรับให้เหมาะสมระหว่าง 0.1uM และ 1.0uM

การเลือกของROX:

ในกระบวนการของปฏิกิริยาเชิงปริมาณ ROX สามารถปรับความแตกต่างของเส้นทางแสง ข้อผิดพลาดในการปิเปต หรือความแตกต่างของปริมาตรที่เกิดจากการระเหยและการควบแน่นได้อย่างสม่ำเสมอ ช่วยเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำของผลลัพธ์อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่าการเลือก ROX เกี่ยวข้องกับตราสารหากเครื่องมือ qPCR มีฟังก์ชันแก้ไขความแตกต่างระหว่างรูโดยอัตโนมัติ ก็ไม่จำเป็นต้องเพิ่ม ROXมิฉะนั้นจะต้องเพิ่มการแก้ไข ROXคู่ค้ารายย่อยในการซื้อรีเอเจนต์ต้องเป็นไปตามเครื่องมือที่ใช้ในการเลือก ROX ที่ถูกต้อง หลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดในภายหลัง

การเตรียมระบบปฏิกิริยา:

ปริมาตรของปฏิกิริยาที่ 20ul และ 50ul เป็นที่พึงประสงค์เรื่องต่อไปนี้ควรให้ความสนใจเมื่อมีการกำหนดระบบ:

1. ต้องเตรียมระบบปฏิกิริยาโดยการระบายอากาศในโต๊ะทำงานที่สะอาดเป็นพิเศษ ddH ใหม่₂O ใช้สำหรับการทดลองแต่ละครั้ง

2. การทดลองแต่ละครั้งจำเป็นต้องเตรียม NTC เพื่อตรวจสอบว่ามีมลพิษในระบบหรือไม่ และ Primer ทุกคู่ต้องทำ NTC ในการเตรียมระบบ

3. ในการตรวจสอบว่ามี gDNA ตกค้างในเทมเพลต RNA หรือไม่ สามารถเตรียม NRT สำหรับแต่ละตัวอย่างเพื่อตรวจหา

4. เมื่อเตรียมระบบ ขอแนะนำให้ทำซ้ำทางเทคนิคอย่างน้อย 3 ครั้งสำหรับหนึ่งตัวอย่าง

5. เมื่อแม่แบบเป็น cDNA แนะนำให้เจือจาง 5-10 เท่าเพื่อลดผลยับยั้งของระบบการถอดรหัสย้อนกลับในการทดลอง qPCRเป็นการดีกว่าที่จะสำรวจปริมาณเทมเพลตด้วยการไล่ระดับสี เพื่อให้ค่า CT อยู่ระหว่าง 20-30

6. กำหนดจำนวนปฏิกิริยาที่ต้องการ เพิ่มขึ้น 5-10% ตามจำนวนปฏิกิริยา และคำนวณจำนวนการกำหนดค่าปริมาตร

7 ระบบเตรียมโดยใช้หลักการพรีมิกซ์ ผสมหลังจากการปั่นแยกและให้แน่ใจว่าไม่มีฟองอากาศ

8, เลือกวัสดุสิ้นเปลืองที่รองรับเท่าที่เป็นไปได้

ชุด RT-qPCR ที่เกี่ยวข้อง