PCR เชิงปริมาณเรืองแสง (หรือที่เรียกว่า TaqMan PCR ซึ่งต่อไปนี้จะเรียกว่า FQ-PCR) เป็นเทคโนโลยีเชิงปริมาณกรดนิวคลีอิกแบบใหม่ที่พัฒนาโดย PE (Perkin Elmer) ในสหรัฐอเมริกาในปี 1995 เทคโนโลยีนี้อิงกับ PCR แบบเดิมโดยการเพิ่มโพรบที่มีฉลากเรืองแสงเมื่อเปรียบเทียบกับ PCR แบบยืดหยุ่นแล้ว FQ-PCR มีข้อดีหลายประการในการตระหนักถึงฟังก์ชันเชิงปริมาณบทความนี้มีวัตถุประสงค์เพื่ออธิบายลักษณะ หลักการ วิธีการ และการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีโดยสังเขป

1 คุณสมบัติ

FQ-PCR ไม่เพียงแต่มีความไวสูงเมื่อเทียบกับ PCR ทั่วไป แต่ยังเนื่องจากการใช้โพรบเรืองแสง ทำให้สามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณเรืองแสงได้โดยตรงระหว่างการขยาย PCR ผ่านระบบการนำไฟฟ้าแบบโฟโตอิเล็กทริก เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เชิงปริมาณ ซึ่งเอาชนะข้อบกพร่องหลายประการของ PCR แบบเดิม ดังนั้นจึงมีความจำเพาะสูงของการผสมดีเอ็นเอและความแม่นยำสูงของเทคโนโลยีสเปกโทรสโกปี

ตัวอย่างเช่น ผลิตภัณฑ์ PCR ทั่วไปจำเป็นต้องได้รับการสังเกตโดย agarose gel electrophoresis และการย้อมด้วย ethidium bromide ด้วยแสงอัลตราไวโอเลตหรือโดย polyacrylamide gel electrophoresis และการย้อมสีด้วยเงินสิ่งนี้ไม่เพียงต้องการเครื่องมือหลายชิ้นเท่านั้น แต่ยังต้องใช้เวลาและความพยายามอีกด้วยคราบสกปรกที่ใช้เอทิเดียมโบรไมด์เป็นอันตรายต่อร่างกายมนุษย์ และขั้นตอนการทดลองที่ซับซ้อนเหล่านี้เปิดโอกาสให้เกิดมลภาวะและผลบวกปลอมอย่างไรก็ตาม FQ-PCR จำเป็นต้องเปิดฝาเพียงครั้งเดียวระหว่างการโหลดตัวอย่าง และกระบวนการที่ตามมาคือการทำงานของท่อแบบปิดอย่างสมบูรณ์ ซึ่งไม่จำเป็นต้องมีการประมวลผลภายหลัง PCR เพื่อหลีกเลี่ยงข้อเสียมากมายในการทำงาน PCR แบบเดิมการทดลองโดยทั่วไปใช้วงจรความร้อน ABI7100 PCR ที่พัฒนาโดยบริษัท PE

เครื่องมือนี้มีลักษณะดังต่อไปนี้: ① ใช้งานได้หลากหลาย: สามารถใช้สำหรับการวัดปริมาณผลิตภัณฑ์ DNA และ RNA PCR, การวิจัยการแสดงออกของยีน, การตรวจจับเชื้อโรค และการปรับเงื่อนไข PCR ให้เหมาะสม② หลักการเชิงปริมาณที่ไม่เหมือนใคร: การใช้โพรบที่มีฉลากเรืองแสง ปริมาณของการเรืองแสงจะสะสมกับวงจร PCR หลังจากการกระตุ้นด้วยเลเซอร์ เพื่อให้บรรลุวัตถุประสงค์ของการวัดปริมาณ③ ประสิทธิภาพการทำงานสูง: วงจรความร้อน 9600 PCR ในตัว คอมพิวเตอร์ควบคุม 1 ถึง 2 ชั่วโมงเพื่อให้การขยายและการหาปริมาณ 96 ตัวอย่างโดยอัตโนมัติและพร้อมกัน④ ไม่จำเป็นต้องใช้เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส: ไม่จำเป็นต้องเจือจางและอิเล็กโทรโฟรีซิสในตัวอย่าง เพียงใช้โพรบพิเศษเพื่อตรวจจับโดยตรงในหลอดปฏิกิริยา⑤ไม่มีมลพิษในท่อ: มีการนำท่อปฏิกิริยาที่ปิดสนิทและระบบการนำไฟฟ้าแบบโฟโตอิเล็กทริกมาใช้ ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องกังวลเกี่ยวกับมลพิษ⑥ผลลัพธ์สามารถทำซ้ำได้: ช่วงไดนามิกเชิงปริมาณสูงถึงห้าลำดับความสำคัญดังนั้น เมื่อเทคโนโลยีนี้ได้รับการพัฒนาจนประสบความสำเร็จ จึงได้รับคุณค่าจากนักวิจัยทางวิทยาศาสตร์จำนวนมากและถูกนำไปประยุกต์ใช้ในหลากหลายสาขา

2 หลักการและวิธีการ

หลักการทำงานของ FQ-PCR คือการใช้กิจกรรม exonuclease 5′→3′ ของเอนไซม์ Taq เพื่อเพิ่มโพรบที่ติดฉลากเรืองแสงให้กับระบบปฏิกิริยา PCRโพรบสามารถไฮบริไดซ์โดยเฉพาะกับแม่แบบ DNA ที่อยู่ในลำดับไพรเมอร์ปลายด้านที่ 5 ของโพรบถูกระบุด้วยยีนที่ปล่อยสารเรืองแสง FAM (6-carboxyfluorescein, การปล่อยสารเรืองแสงสูงสุดที่ 518 นาโนเมตร) และปลายที่ 3 นั้นถูกระบุว่ากลุ่มการดับฟลูออเรสเซนซ์ TAMRA (6-คาร์บอกซีเตตระเมทิลโรดามีน, การปล่อยสารเรืองแสงสูงสุดที่ 582 นาโนเมตร) จุดเริ่มต้นของโพรบที่ 3 จะถูกฟอสโฟรีเลตเพื่อป้องกันไม่ให้โพรบถูก ขยายระหว่างการขยาย PCRเมื่อโพรบไม่เสียหาย กลุ่มดับจะยับยั้งการปล่อยสารเรืองแสงของกลุ่มเปล่งแสงเมื่อกลุ่มเปล่งแสงถูกแยกออกจากกลุ่มดับ การยับยั้งจะถูกยกเลิก และความหนาแน่นของแสงที่ 518 นาโนเมตรจะเพิ่มขึ้นและตรวจพบโดยระบบตรวจจับการเรืองแสง ในเฟสการคืนสภาพธรรมชาติ โพรบจะผสมกับ DNA แม่แบบ และเอนไซม์ Taq ในระยะขยายจะเคลื่อนไปตามแม่แบบ DNA พร้อมกับส่วนขยายของไพรเมอร์เมื่อหัววัดถูกตัด เอฟเฟกต์การดับจะถูกปล่อยและปล่อยสัญญาณเรืองแสงทุกครั้งที่คัดลอกแม่แบบ หัววัดจะถูกตัดออกพร้อมกับปล่อยสัญญาณเรืองแสงเนื่องจากมีความสัมพันธ์แบบหนึ่งต่อหนึ่งระหว่างจำนวนของฟลูออโรฟอร์ที่ปล่อยออกมาและจำนวนของผลิตภัณฑ์ PCR จึงสามารถใช้เทคนิคนี้เพื่อหาปริมาณแม่แบบได้อย่างแม่นยำเครื่องมือทดลองโดยทั่วไปใช้วงจรความร้อน ABI7100 PCR ที่พัฒนาโดยบริษัท PE และสามารถใช้วงจรความร้อนอื่นๆ ได้เช่นกันหากใช้ระบบปฏิกิริยาประเภทปฏิกิริยา ABI7700 สำหรับการทดลอง หลังจากปฏิกิริยาเสร็จสิ้น สามารถให้ผลลัพธ์เชิงปริมาณได้โดยตรงผ่านการวิเคราะห์ด้วยคอมพิวเตอร์หากคุณใช้วงจรความร้อนอื่นๆ คุณต้องใช้เครื่องตรวจจับการเรืองแสงเพื่อวัดสัญญาณการเรืองแสงในหลอดปฏิกิริยาในเวลาเดียวกันเพื่อคำนวณ RQ+, RQ-, △RQRQ+ แสดงถึงอัตราส่วนของความเข้มการเรืองแสงของกลุ่มการเปล่งแสงของหลอดตัวอย่างต่อความเข้มของการเรืองแสงของกลุ่มการดับ RQ- แสดงถึงอัตราส่วนของทั้งสองในหลอดเปล่า △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) แสดงถึงปริมาณของการเปลี่ยนแปลงสัญญาณการเรืองแสงระหว่าง PCR หลังจากการประมวลผลข้อมูล จะได้ผลลัพธ์เชิงปริมาณเนื่องจากการนำหลอดฟลูออเรสเซนต์มาใช้ ความจำเพาะของการทดลองจึงได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญโดยทั่วไปการออกแบบหัววัดควรเป็นไปตามเงื่อนไขต่อไปนี้: ①ความยาวของหัววัดควรอยู่ที่ประมาณ 20-40 ฐานเพื่อให้แน่ใจว่าการผูกมีความเฉพาะเจาะจง②เนื้อหาของเบส GC อยู่ระหว่าง 40% ถึง 60% เพื่อหลีกเลี่ยงการซ้ำซ้อนของลำดับนิวคลีโอไทด์เดี่ยว③ หลีกเลี่ยงการผสมข้ามพันธุ์หรือทับซ้อนกับไพรเมอร์④ ความเสถียรของการยึดเกาะระหว่างโพรบและแม่แบบจะมากกว่าความเสถียรของการยึดเกาะระหว่างไพรเมอร์และแม่แบบ ดังนั้นค่า Tm ของโพรบควรสูงกว่าค่า Tm ของไพรเมอร์อย่างน้อย 5°Cนอกจากนี้ ความเข้มข้นของโพรบ ความคล้ายคลึงกันระหว่างโพรบและลำดับเทมเพลต และระยะห่างระหว่างโพรบและไพรเมอร์ ล้วนมีผลกระทบต่อผลการทดลอง

สินค้าที่เกี่ยวข้อง:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I (ด้วย gDNase) (Super Premix สำหรับการสังเคราะห์ cDNA สายแรกจาก lncRNA) ผู้ผลิตและจำหน่าย |Foregene (foreivd.com)

China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman ผู้ผลิตและผู้จัดจำหน่าย |Foregene (foreivd.com)