RT-qPCR เป็นการทดลองพื้นฐานของอณูชีววิทยา และทุกคนจะต้องคุ้นเคยกับมันประกอบด้วยสามขั้นตอนหลัก: การสกัด RNA การถอดรหัสแบบย้อนกลับเป็น cDNA และ PCR เชิงปริมาณเรืองแสงตามเวลาจริงช่วยไม่ได้ เกิดอะไรขึ้น?มีแนวโน้มว่ามีปัญหาเกี่ยวกับการทดลองถอดความแบบย้อนกลับ!แม้ว่าดูเหมือนว่าการทดลองการถอดความแบบย้อนกลับจะต้องเพิ่ม RNA, dNTP, ไพรเมอร์ และทรานสคริปเทสย้อนกลับไปยังหลอดปั่นเหวี่ยงและผสมให้เข้ากัน แต่ในขั้นตอนการปฏิบัติงานจริงยังมีรายละเอียดที่ต้องใส่ใจอีกมากมาเรียนรู้กัน!

จะตัดสินคุณภาพของ RNA ได้อย่างไร?
เพื่อให้ได้ cDNA คุณภาพของ RNA นั้นสำคัญมาก!คุณภาพของ RNA สามารถตรวจจับได้จากสองด้านหลัก:
(1) ความสมบูรณ์ของ RNA:สามารถตรวจสอบความสมบูรณ์ของ RNA ได้โดย agarose gel electrophoresis. ยกตัวอย่างยูคารีโอต RNA ทั้งหมดมีแถบใสสามแถบ น้ำหนักโมเลกุลจากใหญ่ไปเล็กคือ 28S, 18S และ 5S และ 28S สว่างเป็นสองเท่าของ 18S;หากมองเห็นได้ 3 แถบ แต่แถบชนิดนั้นเบลอหรือ Diffusion หมายความว่า RNA ถูกย่อยสลายบางส่วนในขณะนี้ โปรดทำปฏิกิริยาการถอดความแบบย้อนกลับทันที และเพิ่มการป้อนเทมเพลตอย่างเหมาะสมหากมองเห็นเฉพาะแถบที่มีน้ำหนักโมเลกุลเล็กหรือไม่มีแถบเลย แสดงว่า RNA นั้นสลายตัวไปหมดแล้วและจำเป็นต้องสกัดใหม่Agilent 2100 บ่งชี้ความสมบูรณ์ของ RNA ด้วยแผนภาพสูงสุดและค่า RINถ้ากรดนิวคลีอิกไม่เสียหาย เส้นฐานของอิเล็กโทรฟีโรแกรมจะแบนถ้ากรดนิวคลีอิกถูกย่อยสลายอย่างรุนแรง ค่าพื้นฐานจะไม่สม่ำเสมอและจุดสูงสุดของการย่อยสลายจะปรากฏขึ้นค่าของ RIN สะท้อนถึงความสมบูรณ์ของ RNA ซึ่งอยู่ในช่วง 0-10 ยิ่งมีค่ามาก คุณภาพของ RNA ก็ยิ่งดีขึ้นเท่านั้นระดับความสมบูรณ์ที่สูงขึ้น
(2) ความบริสุทธิ์ของ RNA:สามารถตรวจจับอัตราส่วนของ OD260/280 ได้ด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UVถ้าอัตราส่วน OD260/280 อยู่ระหว่าง 1.9 ถึง 2.1 แสดงว่ามีความบริสุทธิ์ดีมาก
DNA ของจีโนมที่ตกค้างอาจนำไปสู่ผลลัพธ์เชิงปริมาณที่ไม่ถูกต้อง
เมื่อสกัด RNA แล้ว RNA ที่เราได้รับอาจผสมกับ DNA ของจีโนม (gDNA) ที่ยังไม่ได้ทำความสะอาดดังนั้น cDNA หลังจากการถอดความแบบย้อนกลับจะถูกผสมด้วยจีดีเอ็นเอ.ระหว่างล่องคิวพีซีอาร์ปฏิกิริยา,ซีดีเอ็นเอและ gDNA อาจถูกขยายพร้อมกัน ส่งผลให้ค่า CT ค่อนข้างน้อย ดังนั้นผลลัพธ์ที่ได้อาจมีอคติ
แล้วเราควรทำอย่างไรในสถานการณ์นี้?ฟอร์เจนแนะนำ:
(1) ดำเนินการทำความสะอาดจีโนมบน RNA ที่ย้อนกลับ ซึ่งสามารถลบออกได้โดยการสกัดคอลัมน์ระหว่างการสกัด RNA
(2) รักษา RNA ที่สกัดด้วย DNaseI แต่ยุติด้วย EDTA;
ของรีเอเจนต์การถอดความแบบย้อนกลับด้วยโมดูลการล้างจีโนม ;

วิธีการเลือกไพรเมอร์สำหรับการถอดความแบบย้อนกลับ?
ไพรเมอร์การถอดรหัสแบบย้อนกลับยังส่งผลต่อผลลัพธ์ของปฏิกิริยาการถอดรหัสแบบย้อนกลับคุณสามารถเลือกไพรเมอร์แบบสุ่ม Oligo dT หรือไพรเมอร์เฉพาะยีนสำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับตามสถานการณ์เฉพาะของการทดลอง:
(1) ใบรับรองผลการเรียนเฉพาะ: แนะนำให้ใช้ไพรเมอร์เฉพาะยีน
(2) การถอดเสียงส่วนยาว: แนะนำให้ใช้ไพรเมอร์ Oligo dT/ยีนเฉพาะ;
(3) ชิ้นส่วนภายในของการถอดเสียงส่วนยาว: ไพรเมอร์เฉพาะยีน/ ไพรเมอร์แบบสุ่ม/ ไพรเมอร์สุ่ม + Oligo dTหากทำการทดลอง qPCR ในภายหลัง จะไม่สามารถใช้ Oligo dT เพียงอย่างเดียวได้ เนื่องจากการใช้ Oligo dT เพียงอย่างเดียวอาจทำให้เกิด 3′ end bias ซึ่งนำไปสู่ผลการทดลอง qPCR ที่ไม่ถูกต้อง
(4) มิอาร์เอ็นเอ: สามารถใช้ไพรเมอร์ Stem-loop หรือหางหางได้

cDNA ของผลิตภัณฑ์การถอดความแบบย้อนกลับควรเจือจางเพื่อการหาปริมาณกี่ครั้ง
หลังจากได้รับ cDNA ของผลิตภัณฑ์การถอดรหัสแบบย้อนกลับ จำนวนครั้งที่ควรเจือจาง cDNA สำหรับการทดลอง qPCR นั้นมีความสำคัญมากหากความเข้มข้นของ cDNA สูงหรือต่ำเกินไป ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณอาจได้รับผลกระทบสามารถวัดความเข้มข้นของ cDNA ได้หรือไม่ และควรทำอย่างไร?
(1) ไม่สามารถวัดความเข้มข้นของ cDNA ของผลิตภัณฑ์การถอดรหัสแบบย้อนกลับได้ เนื่องจากนอกเหนือจากผลิตภัณฑ์ cDNA แล้ว ผลิตภัณฑ์การถอดรหัสแบบย้อนกลับยังมีบัฟเฟอร์ที่เหลือของการถอดรหัสแบบย้อนกลับ รีเวิร์สทรานสคริปเทส ไพรเมอร์ ฯลฯ ซึ่งจะรบกวนผลการวัดความเข้มข้นและทำให้อัตราส่วน OD260/280, OD260/230 ผิดปกติ ดังนั้นจึงไม่สะท้อนผลผลิต cDNA ที่แท้จริงในเวลานี้เพื่อนบางคนจะบอกว่าฉันจะวัดความเข้มข้นหลังจากการทำให้บริสุทธิ์ในที่นี้ Foregene ขอเตือนว่าไม่แนะนำให้ทำให้บริสุทธิ์ cDNA เนื่องจากความยาวของ cDNA ที่ได้จากการย้อนกลับนั้นแตกต่างกัน และ cDNA ที่สั้นจะสูญเสียไปในการทำให้บริสุทธิ์
(2) แล้วจะทำอย่างไร?ก่อนการทดลอง qPCR สามารถกำหนดเกรเดียนต์การเจือจางของ cDNA ได้ผ่านการทดลองก่อนตัวอย่างเช่น: ใช้สารละลายสต็อก cDNA, การเจือจาง 10 เท่า และการเจือจาง 100 เท่าเป็นแม่แบบสำหรับการทดลอง qPCR และเลือกปัจจัยการเจือจางด้วยค่า CT ในช่วง 18-28

miRNAs ควรถอดความแบบย้อนกลับอย่างไร
miRNA เป็น RNA โมเลกุลขนาดเล็กสายเดี่ยวที่มีขนาดประมาณ 22 nt ที่ไม่มีรหัสสำหรับโปรตีนเนื่องจากความยาวสั้น วิธี qPCR แบบเดิมจึงเป็นเรื่องยากที่จะหาปริมาณโดยตรง ดังนั้นจึงจำเป็นต้องขยาย miRNA บ่อยครั้งวิธีการถอดรหัสแบบย้อนกลับที่ใช้กันทั่วไปสำหรับ miRNA รวมถึงวิธีสเต็มลูปและวิธีการหาง
วิธีสเต็มลูปคือการขยาย miRNA โดยการเพิ่มไพรเมอร์สเต็มลูปวิธีการตรวจจับนี้มีความไวและความจำเพาะสูงกว่า แต่ปริมาณการตรวจจับต่ำการถอดความแบบย้อนกลับหนึ่งรายการสามารถตรวจจับ miRNA และการอ้างอิงภายในได้เพียงหนึ่งรายการเท่านั้นวิธีการเพิ่มหางประกอบด้วยสองวิธี เสร็จสิ้นโดยการกระทำร่วมกันของเอนไซม์สองตัว ซึ่งได้แก่ PolyA polymerase และ Reverse TranscriptasePolyA polymerase มีหน้าที่ในการเพิ่ม PolyA tails ให้กับ miRNA เพื่อเพิ่มความยาวของมัน และ reverse transcriptase จะทำปฏิกิริยาการถอดรหัสแบบย้อนกลับวิธีนี้มีทรูพุตการตรวจจับสูงและสามารถตรวจจับ miRNA และการอ้างอิงภายในได้หลายรายการในการถอดความแบบย้อนกลับครั้งเดียว แต่ความไวและความจำเพาะจะต่ำในวิธีสเต็มลูป