Real Time PCR หรือที่เรียกว่า quantitative PCR หรือ qPCR เป็นวิธีการตรวจสอบและวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณ PCR แบบเรียลไทม์
เนื่องจาก PCR เชิงปริมาณมีข้อดีของการทำงานที่ง่าย สะดวก รวดเร็ว มีความไวสูง ทำซ้ำได้ดี และอัตราการปนเปื้อนต่ำ จึงใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดสอบทางการแพทย์ การประเมินประสิทธิภาพของยา การวิจัยการแสดงออกของยีน การวิจัยดัดแปรพันธุกรรม การตรวจจับยีน การตรวจจับเชื้อโรค การตรวจจับสัตว์และพืชการทดสอบอาหารและสาขาอื่นๆ
ดังนั้น ไม่ว่าคุณจะมีส่วนร่วมในการวิจัยพื้นฐานด้านชีววิทยาศาสตร์ หรือพนักงานของบริษัทยา บริษัทสัตวบาล บริษัทอาหาร หรือแม้แต่พนักงานของสำนักงานตรวจเข้า-ออกและกักกัน แผนกตรวจสอบสิ่งแวดล้อม โรงพยาบาล และหน่วยงานอื่นๆ คุณจะต้องมีประสบการณ์ไม่มากก็น้อย หรือคุณจำเป็นต้องรู้ความรู้เกี่ยวกับการควบคุม PCR เชิงปริมาณ

หลักการเรียลไทม์พีซีอาร์

PCR แบบเรียลไทม์เป็นวิธีการที่เพิ่มสารเรืองแสงลงในระบบปฏิกิริยา PCR และความเข้มของสัญญาณเรืองแสงในกระบวนการของปฏิกิริยา PCR จะถูกตรวจสอบแบบเรียลไทม์โดยเครื่องมือ PCR เชิงปริมาณ และสุดท้าย ข้อมูลการทดลองจะได้รับการวิเคราะห์และประมวลผล

【เส้นโค้งการขยาย】เป็นเส้นโค้งที่อธิบายกระบวนการไดนามิกของ PCRเส้นโค้งการขยายของ PCR ไม่ใช่เส้นโค้งเอ็กซ์โปเนนเชียลมาตรฐาน แต่เป็นเส้นโค้งซิกมอยด์

[ระยะแพลตฟอร์มของเส้นโค้งการขยาย]ด้วยการเพิ่มจำนวนของรอบ PCR, การหยุดทำงานของ DNA polymerase, การลดลงของ dNTPs และไพรเมอร์ และการยับยั้งปฏิกิริยาการสังเคราะห์โดยผลพลอยได้จากปฏิกิริยาไพโรฟอสเฟต ฯลฯ PCR ไม่ได้ขยายตัวแบบทวีคูณเสมอไปและในที่สุดก็จะเข้าสู่ที่ราบสูง

[ขอบเขตการเติบโตแบบทวีคูณของเส้นโค้งการขยาย]แม้ว่าช่วงของที่ราบสูงจะแตกต่างกันอย่างมาก แต่ในบางพื้นที่ของพื้นที่การเติบโตแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของเส้นโค้งการขยาย ความสามารถในการทำซ้ำนั้นดีมาก ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญมากสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ PCR

[ค่าเกณฑ์และค่า Ct]เราตั้งค่าขีดจำกัดของการตรวจจับการเรืองแสงที่ตำแหน่งที่เหมาะสมในพื้นที่การเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลของเส้นโค้งการขยาย ซึ่งก็คือค่าเกณฑ์ (Threshold)จุดตัดของค่าเกณฑ์และเส้นโค้งการขยายคือค่า Ct นั่นคือค่า Ct หมายถึงจำนวนรอบ (รอบเกณฑ์) เมื่อถึงค่าเกณฑ์

กราฟด้านล่างแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงความสัมพันธ์ระหว่างเส้นเกณฑ์และเส้นโค้งการขยาย เกณฑ์และค่า Ct

【วิธีการหาปริมาณ?】

ได้รับการพิสูจน์โดยทฤษฎีทางคณิตศาสตร์ว่าค่า Ct มีความสัมพันธ์เชิงเส้นผกผันกับลอการิทึมของจำนวนเทมเพลตเริ่มต้นPCR ตามเวลาจริงจะตรวจสอบผลิตภัณฑ์การขยายสัญญาณ PCR แบบเรียลไทม์และวัดปริมาณผลิตภัณฑ์เหล่านั้นในระหว่างขั้นตอนการขยายสัญญาณแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล

สำหรับแต่ละรอบของ PCR นั้น DNA จะเพิ่มขึ้นอย่างทวีคูณถึง 2 เท่า และในไม่ช้าก็ถึงจุดที่ราบสูง

สมมติว่าจำนวนของ DNA เริ่มต้นคือ A₀ หลังจาก n รอบ ปริมาณผลิตภัณฑ์ DNA ตามทฤษฎีสามารถแสดงเป็น:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

จากนั้น ยิ่งปริมาณ DNA เริ่มต้น A 0 มากเท่าใด ปริมาณผลิตภัณฑ์ที่ขยายจะถึงค่าการตรวจจับ An เร็วขึ้น และจำนวนรอบเมื่อถึงค่า An ก็จะเท่ากับค่า Ctนั่นคือ ยิ่งปริมาณ DNA เริ่มต้น A 0 มากเท่าใด เส้นกราฟการขยายก็จะถึงจุดสูงสุดเร็วขึ้น และจำนวนรอบ n ที่ต้องการก็จะยิ่งน้อยลงตามไปด้วย

เราดำเนินการเจือจางแบบไล่ระดับของมาตรฐานของความเข้มข้นที่รู้จักและใช้เป็นแม่แบบสำหรับ Real Time PCR และชุดของเส้นโค้งการขยายจะได้รับในช่วงเวลาที่เท่ากันตามลำดับการเริ่มต้นของจำนวน DNA จากมากไปน้อยตามความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างค่า Ct และลอการิทึมของจำนวนแม่แบบเริ่มต้น ก[เส้นโค้งมาตรฐาน] สามารถสร้างได้

โดยการแทนค่า Ct ของตัวอย่างที่ไม่ทราบความเข้มข้นลงในกราฟมาตรฐาน ก็จะได้ปริมาณแม่แบบเริ่มต้นของตัวอย่างที่ไม่ทราบความเข้มข้น ซึ่งเป็นหลักการเชิงปริมาณของ Real Time PCR

วิธีการตรวจจับของ Real Time PCR

PCR แบบเรียลไทม์ตรวจจับผลิตภัณฑ์ขยาย PCR โดยตรวจจับความเข้มของแสงเรืองแสงในระบบปฏิกิริยา

หลักการฝังสีย้อมเรืองแสง】

สีย้อมเรืองแสงเช่น TB Green ® สามารถจับแบบไม่เจาะจงกับ DNA สายคู่ในระบบ PCR และเรืองแสงเมื่อจับ

ความเข้มของการเรืองแสงในระบบปฏิกิริยาเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณเมื่อเพิ่มรอบ PCRด้วยการตรวจจับความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนซ์ ทำให้สามารถตรวจสอบปริมาณการขยายของ DNA ในระบบปฏิกิริยาได้แบบเรียลไทม์ จากนั้นจึงประมาณปริมาณแม่แบบเริ่มต้นในตัวอย่างแบบย้อนกลับได้

【หลักการของวิธีฟลูออเรสเซนต์โพรบ】

หัววัดเรืองแสงเป็นลำดับกรดนิวคลีอิกที่มีกลุ่มเรืองแสงที่ปลาย 5′ และกลุ่มดับที่ปลาย 3′ ซึ่งสามารถจับกับแม่แบบได้อย่างเฉพาะเจาะจงเมื่อโพรบไม่เสียหาย การเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจากฟลูออโรฟอร์จะถูกดับโดยกลุ่มดับและไม่สามารถเรืองแสงได้เมื่อโพรบถูกย่อยสลาย สารเรืองแสงจะแยกตัวออกและปล่อยสารเรืองแสงออกมา

เพิ่มโพรบเรืองแสงในสารละลายปฏิกิริยา PCRในระหว่างกระบวนการหลอม หัววัดเรืองแสงจะจับกับตำแหน่งเฉพาะของแม่แบบในระหว่างกระบวนการขยาย กิจกรรม exonuclease 5′→3′ ของเอนไซม์ PCR สามารถย่อยสลายโพรบเรืองแสงที่ผสมกับแม่แบบ และสารเรืองแสงจะแยกตัวออกเพื่อเปล่งแสงเรืองแสงด้วยการตรวจจับความเข้มของการเรืองแสงของโพรบในระบบปฏิกิริยา วัตถุประสงค์ของการตรวจสอบปริมาณการขยายของผลิตภัณฑ์ PCR สามารถบรรลุได้

【การเลือกวิธีการตรวจจับการเรืองแสง】

หากใช้เพื่อแยกความแตกต่างของลำดับที่มีความคล้ายคลึงกันสูงและทำการตรวจจับแบบมัลติเพล็กซ์ PCR เช่น การวิเคราะห์การพิมพ์ SNP วิธีการโพรบเรืองแสงนั้นไม่สามารถถูกแทนที่ได้
สำหรับการทดลอง PCR ตามเวลาจริงอื่นๆ สามารถใช้วิธีไคเมร่าฟลูออเรสเซนต์ที่ง่าย สะดวก และต้นทุนต่ำได้

โพรบมีความจำเพาะเจาะจงสูง มีความสามารถในมัลติเพล็กซ์ PCR

ข้อบกพร่อง

ข้อกำหนดเฉพาะสูงสำหรับการขยาย;

ไม่สามารถดำเนินการมัลติเพล็กซ์ PCR จำเป็นต้องออกแบบโพรบเฉพาะ ค่าใช้จ่ายสูง

บางครั้งการออกแบบโพรบก็ยาก

สินค้าที่เกี่ยวข้อง: