RNase เป็นคำที่ละเอียดอ่อนซึ่งนักเรียนหลายคนที่ทำการทดลองสกัด RNA มักไม่ต้องการได้ยินอาวุธครบมือ RNA ที่ถูกสกัดด้วยรีเอเจนต์ฟีนอลและคลอโรฟอร์มที่เป็นพิษสูงในที่สุดก็ถูกย่อยสลายฉันไม่ง้อ!!!วันนี้เรามาดูที่มาของ Rnase อันโด่งดังกัน

Ribonuclease (RNase) หรือ RNase เป็นนิวคลีเอสที่สามารถไฮโดรไลซ์ RNA ให้เป็นโมเลกุลขนาดเล็กRNase ซึ่งเป็นโปรตีนโมเลกุลขนาดเล็กมีความเสถียรผิดปกติ .การฆ่าเชื้อด้วยไอน้ำแรงดันสูงและความดันสูงแบบดั้งเดิมและสารยับยั้งโปรตีนไม่สามารถปิดการใช้งานได้อย่างสมบูรณ์ความเสถียรของ RNase ส่วนใหญ่มาจากพันธะไดซัลไฟด์ในโครงสร้างตัวอย่างเช่น RNase ของตับอ่อนวัวที่ใช้กันทั่วไปมีกรดอะมิโนเพียง 124 ตัว แต่มีพันธะไดซัลไฟด์ 4 ตัวพันธะซัลเฟอร์และพันธะไดซัลไฟด์ช่วยให้ RNase มีเสถียรภาพทางความร้อนที่ดีเยี่ยมนอกจากนี้ rnase ยังมีน้ำหนักโมเลกุลที่ค่อนข้างเล็กและสามารถคืนรูปเดิมได้อย่างรวดเร็วในหลายกรณี

นอกจากจะมีความเสถียรสูงแล้วRNases มีอยู่ทั่วไปในห้องปฏิบัติการ .RNase เป็นกลไกการป้องกันทางชีวภาพสำหรับเซลล์ RNA ภายนอกมักเป็นอันตรายถึงชีวิตเมื่อเปรียบเทียบกับ DNA จากภายนอกแล้ว RNA จากภายนอกมักจะเป็นอันตรายมากกว่าRNA ได้รับการถอดความและแปลอย่างมีความสุข ดังนั้นสิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมดจึงพัฒนา RNases เพื่อป้องกันการบุกรุกของ RNA จากภายนอกดังนั้นเซลล์แบคทีเรียที่เพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการและคุณที่สกัด RNA จึงคายกลิ่นของ RNaseของเหลวในร่างกายมนุษย์ (น้ำลาย น้ำตา ฯลฯ) มี RNase ในปริมาณมาก ดังนั้นอย่าร้องไห้เมื่อ RNA เสื่อมสภาพยิ่งร้อง RNA ยิ่งเสื่อม!!Sister Daiyu ไม่เหมาะสำหรับการสกัด RNA!

นอกจากนี้ ผิวที่บอบบางของคุณยังมี RNase จำนวนมาก และเครื่องหมาย ปิเปต ประตูตู้เย็น และที่จับประตูที่สัมผัสกับผิวหนังก็มี RNase เช่นกัน

เรามาดูวิธีการจัดการกับ RNases กัน

สิ่งแรกที่ทุกคนนึกถึงเมื่อถอด RNA คือกพ(ไดเอทิลไพโรคาร์บอเนต)DEPC ทำลายธรรมชาติของโปรตีนเป็นส่วนใหญ่โดยการรวมตัวกับวงแหวน imidazole ของฮิสทิดีนกลุ่มที่ใช้งาน RNase ซึ่งจะช่วยยับยั้งการทำงานของเอนไซม์DEPC 0.1% สามารถมีผลการกำจัด Rnase ได้ดีกว่า แต่เราต้องให้ความสนใจว่า DEPC เป็นสารก่อมะเร็งที่รู้จัก ดังนั้นควรให้ความสนใจเป็นพิเศษเมื่อใช้

สำหรับ RNase เราต้องเริ่มจากสองด้านประการแรกคือการยับยั้งการทำงานของ RNase ภายในร่างกาย

รีเอเจนต์การสกัด RNA ทั่วไป เช่น guanidine isothiocyanate และ DTT ที่มีอยู่ใน Trizol สามารถเปิดพันธะไดซัลไฟด์ของ RNase ได้ แต่ยังมี RNases บางชนิด โดยเฉพาะในตัวอย่างเนื้อเยื่อ ดังนั้นให้ใส่ใจกับอุณหภูมิต่ำ

1.จุ่มตัวอย่างเนื้อเยื่อทันทีในไนโตรเจนเหลวหลังจากนำออกมา หรือในสารละลายถนอม RNA ที่มีจำหน่ายทั่วไป

2.หลังจากแยก RNA ของตัวอย่างเซลล์แล้ว ให้เพิ่มลงในสารละลายสลายและวางลงบนกล่องน้ำแข็ง

3. ควรใช้ไนโตรเจนเหลวในการบด เมื่อตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันเมื่อใช้โฮโมจีไนเซอร์แบบไฟฟ้าที่ไม่มีไนโตรเจนเหลว ให้ใส่ใจกับการทำให้ตัวต่อโฮโมจีเนตเย็นลงจนสุด

ประการที่สองคือ DNase จากภายนอก

1.ติดอาวุธครบมือ สวมเสื้อกาวน์ สวมหน้ากาก และอย่าลืมสวมถุงมือใหม่ (อย่าประหยัดมาก!! ควรสังเกตว่า Trizol นั้นมีฤทธิ์กัดกร่อนสูง และยังแรงมากเมื่อผ่านถุงมือ ดังนั้นอย่าหยดลงบนมือของคุณ)

2.ทิปปิเปต, หลอด EP, หลอด PCR และอุปกรณ์อื่นๆ ที่ใช้แล้วทั้งหมดต้องได้รับการบำบัดด้วย de-RNaseสามารถแช่ใน DEPC 0.1% แล้วอัดภายใต้แรงดันสูงให้ความสนใจกับการทำงานในตู้ดูดควันทรราชท้องถิ่นสามารถซื้อวัสดุสิ้นเปลืองสำหรับกำจัดเอนไซม์ได้โดยตรง

PS: ให้ฉันบอกคุณวิธีการขี้เกียจแม้ว่าอุณหภูมิสูงและความดันสูงจะไม่สามารถกำจัด RNase ได้อย่างสมบูรณ์ แต่จะกำจัดส่วนใหญ่ออกไปอุณหภูมิสูงและความดันสูง 2 เท่ามีผลดี และการสกัด RNA มีผลเพียงเล็กน้อย

3.แอลกอฮอล์สามารถทำลายโปรตีนดังนั้นจึงสามารถเช็ดโต๊ะสกัด RNA ด้วยแอลกอฮอล์ 75% และถุงมือยังสามารถฉีดแอลกอฮอล์ได้อีกด้วย

4.สารละลายละลาย RNA สุดท้ายและหลอดปั่นแยกควรได้รับการบำบัดด้วย de-RNaseน้ำ DEPC เป็นสารละลายละลาย RNA ที่ใช้กันทั่วไปพูดคุยเกี่ยวกับวิธีการเตรียมน้ำ DEPC ที่ถูกต้อง (อย่าลืมบรรจุ DEPC เชิงพาณิชย์ใหม่เมื่อคุณซื้อ)

เติม DEPC ลงในน้ำบริสุทธิ์พิเศษที่ 1:1000 เขย่าขวด ปล่อยให้ค้างคืนที่อุณหภูมิ 37°C และฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121°C ภายใต้อุณหภูมิสูงและความดันสูงเป็นเวลา 15 นาทีน้ำ DEPC สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C ในปริมาณ 1 มล.

สรุป: อุณหภูมิต่ำเป็นกุญแจสำคัญ จัดการวัสดุสิ้นเปลืองได้ดี มีอาวุธครบมือ และพูดคุยน้อยลง!

เป็นอันว่าสำหรับกลยุทธ์ในวันนี้ฉันขอให้คุณมีความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของ RNA ที่คุณกล่าวถึงทั้ง A260/A280 เป็น 2.0!!!

แน่นอนถ้าคุณใช้ชุดสกัด RNA การทำงานที่อุณหภูมิห้องคุณอาจไม่พบปัญหาข้างต้น

การทำงานที่อุณหภูมิห้องโดยไม่ต้องเติม DNase ดึง RNA ทั้งหมดออกจากเซลล์ในเวลา 11 นาที และแยก RNA ทั้งหมดออกจากเนื้อเยื่อของสัตว์หรือพืชในเวลา 30 นาที

สนใจตัวอย่างทดลอง ติดต่อได้ที่overseas@foregene.com

สินค้าที่เกี่ยวข้อง:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/