เมื่อเร็ว ๆ นี้ฉันค้นพบสิ่งที่น่าทึ่ง!ผู้เชี่ยวชาญด้านการทดลองขั้นสูงหลายคนที่อยู่รอบตัวเขาไม่รู้แม้แต่ประเด็นความรู้พื้นฐานด้านการทดลอง

ตัวอย่างเช่น คุณสามารถตอบคำถามต่อไปนี้ได้หรือไม่?

มีความแตกต่างระหว่าง OD260 และ A260 หรือไม่?แต่ละอย่างหมายความว่าอย่างไร?
OD เป็นตัวย่อของความหนาแน่นของแสง (ความหนาแน่นของแสง) A เป็นตัวย่อของการดูดกลืนแสง (การดูดซับ) แนวคิดทั้งสองเหมือนกันจริง ๆ แล้ว "ความหนาแน่นของแสง" คือ "การดูดซับ" แต่ "ความหนาแน่นของแสง" เป็นไปตามมาตรฐานแห่งชาติส่วนใหญ่และเป็นมาตรฐานมากขึ้น

โดยปกติเราจะวัดค่า OD ที่ 260nm เพื่อคำนวณความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิก แล้ว 1OD หมายถึงอะไร
กรดนิวคลีอิกมีจุดสูงสุดในการดูดซึมสูงสุดที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร ซึ่งมีทั้ง DNA และ RNA รวมถึงชิ้นส่วนของกรดนิวคลีอิกที่แยกส่วน (นี่คือประเด็นสำคัญ)
ค่า OD ที่วัดที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตรถูกบันทึกเป็น OD260หากตัวอย่างบริสุทธิ์ ค่า OD260 สามารถคำนวณความเข้มข้นของตัวอย่างกรดนิวคลีอิกได้
1 OD260=50 ไมโครกรัม/มล. dsDNA (DNA แบบเกลียวคู่)
=37 ไมโครกรัม/มล. ssDNA (ดีเอ็นเอสายเดี่ยว)
= 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร RNA
=30 μg/ml dNTPs (โอลิโกนิวคลีโอไทด์)
มีความเชื่อมโยงและความแตกต่างระหว่าง RT-PCR, Realtime-PCR และ QPCR หรือไม่?
RT-PCR ย่อมาจาก Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR ย่อมาจาก Quantitative Real Time PCR
แม้ว่า Real Time PCR (เรียลไทม์ฟลูออเรสเซนต์เชิงปริมาณ PCR) และ Reverse Transcription PCR (reverse transcription PCR) ทั้งคู่ดูเหมือนจะเรียกโดยย่อว่า RT-PCRแต่อนุสัญญาระหว่างประเทศคือ: RT-PCR หมายถึง PCR การถอดความแบบย้อนกลับโดยเฉพาะ

อะไรคือ nt, bp และ kb ที่ใช้กันทั่วไปเพื่ออธิบายความยาวของ DNA/RNA ในชีววิทยา
nt = นิวคลีโอไทด์
bp = คู่เบส คู่เบส
kb = กิโลเบส

แน่นอนว่าหลายคนมักไม่ใส่ใจกับรายละเอียดเล็กๆ น้อยๆ เหล่านี้!ทุกคนทำเช่นนี้และไม่มีใครจะถามคุณว่ามันคืออะไรคุณรู้ว่ามันไม่จำเป็นใช่ไหม?

ไม่ ไม่ ไม่ จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องรู้เรื่องนี้!เพราะเหตุใด
เพราะต้องการลงบทความ!พี่ชาย!ไม่ว่าคุณจะมีเป้าหมายในการสำเร็จการศึกษาหรือบรรลุผลงานวิจัยทางวิทยาศาสตร์ คุณต้องพึ่งพาบทความในการพูด!

การสกัดกรดนิวคลีอิกควรเป็นการทดลองที่ง่ายและเป็นพื้นฐานที่สุดคุณภาพของการสกัดกรดนิวคลีอิกเป็นตัวกำหนดผลลัพธ์ของการทดลองที่ตามมาโดยตรง

แม้จะพูดไปหลายครั้งแล้ว แต่ก็ยังมีเพื่อนๆ หลายคนที่ไม่สนใจคราวนี้ฉันตัดสินใจย้ายออกจากบทความ!

ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่การทดลอง PCR ตามเวลาจริงเชิงปริมาณ ซึ่งเรียกว่า MIQEเป็นชุดแนวทางการทดลองเชิงปริมาณของฟลูออเรสเซนซ์ที่เปิดตัวในระดับสากล ซึ่งเสนอมาตรฐานขั้นต่ำสำหรับข้อมูลการทดลองที่จำเป็นสำหรับการประเมินการทดลอง PCR เชิงปริมาณของฟลูออเรสเซนซ์และเผยแพร่บทความด้วยเงื่อนไขการทดลองและวิธีการวิเคราะห์ที่ผู้ทดลองจัดเตรียมไว้ ผู้ตรวจสอบสามารถประเมินความถูกต้องของแผนการทดลองของผู้วิจัยได้ดีขึ้น

จะเห็นได้ว่าในส่วนของการสกัดกรดนิวคลีอิกได้เสนอรายการตรวจดังต่อไปนี้

“E” หมายถึงข้อมูลที่ต้องระบุ และ “D” หมายถึงข้อมูลที่ควรระบุหากจำเป็น

แบบฟอร์มซับซ้อนมากอันที่จริงฉันอยากจะบอกว่าทุกคนต้องเริ่มจาก

ความบริสุทธิ์ (D), ผลผลิต (D), ความสมบูรณ์ (E) และความสม่ำเสมอ (E) เพื่อประเมินกรดนิวคลีอิกในสี่ด้านนี้

ตามนิสัยการทดลอง ก่อนอื่นให้พูดถึงวิธีการประเมินความบริสุทธิ์และความเข้มข้น

การวัดค่า OD เป็นวิธีการตรวจจับที่ผู้ทดลองชื่นชอบและง่ายที่สุดสำหรับหลักการผมจะไม่ลงรายละเอียดในที่นี้ปัจจุบันห้องปฏิบัติการหลายแห่งใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบอัลตร้าไมโครเพื่อวิเคราะห์ตัวอย่างกรดนิวคลีอิกเชิงปริมาณโดยตรงในขณะที่แสดงค่าการดูดกลืนแสง โปรแกรมจะให้ค่าความเข้มข้นโดยตรง (กรดนิวคลีอิก โปรตีน และสีย้อมเรืองแสง) และอัตราส่วนที่เกี่ยวข้องส่วนการวิเคราะห์ค่า OD ให้ Save รูปนี้ไว้ ไม่เป็นไรครับ

รายการโซลูชันค่า OD สากล

อย่างไรก็ตาม มีข้อแม้บางประการที่ต้องแยกออกมาต่างหากสำหรับคุณ

(ท้ายที่สุด ฉันรู้ว่าคุณต้องเป็นคนที่เก็บออมและรอจนกว่าคุณต้องการมัน!)

หมายเหตุ 1 อุปกรณ์

ค่า OD จะได้รับผลกระทบจากอุปกรณ์ต่างๆตราบใดที่ OD260 อยู่ในช่วงที่กำหนด ค่าของ OD230 และ OD280 จะมีความหมายตัวอย่างเช่น ช่วงการดูดกลืนแสงของ Eppendorf D30 ทั่วไปที่ 260nm คือ 0~3A และ NanoDrop One ของ Thermo อยู่ที่ 260nmช่วงการดูดกลืนแสง 0.5~62.5A.

โน้ต 2น้ำยาเจือจาง

ค่า OD อาจได้รับผลกระทบจากการเจือจางของรีเอเจนต์ต่างๆตัวอย่างเช่น การอ่านค่า OD260/280 ของ RNA บริสุทธิ์ในค่า pH7.5 10มม ทริสบัฟเฟอร์อยู่ระหว่าง 1.9-2.1 ขณะที่ในสารละลายที่เป็นกลางอัตราส่วนจะลดลง อาจจะแค่ 1.8-2.0 แต่ไม่ได้หมายความว่าคุณภาพของ RNA จะเปลี่ยนความแตกต่าง

หมายเหตุ 3สารตกค้าง

การมีอยู่ของสารตกค้างจะส่งผลต่อความแม่นยำของการวัดความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิก ดังนั้นจึงจำเป็นต้องหลีกเลี่ยงโปรตีน ฟีนอล โพลีแซคคาไรด์ และโพลีฟีนอลตกค้างในตัวอย่างกรดนิวคลีอิกให้มากที่สุด

อย่างไรก็ตาม ในความเป็นจริงแล้ว การสกัดสารอินทรีย์เป็นวิธีการแบบเก่าในชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์ ผลการสกัดสามารถทำได้ผ่านคอลัมน์การดูดซับที่มีซิลิการ่วมกับการหมุนเหวี่ยง การหลีกเลี่ยงสารอินทรีย์ที่เป็นพิษและเป็นอันตรายซึ่งยากต่อการกำจัด เป็นต้น ปัญหาเช่นชุดสกัดกรดนิวคลีอิกของ Foregene ไม่ใช้ DNase/RNase และรีเอเจนต์อินทรีย์ที่เป็นพิษตลอดการทำงาน รวดเร็วและปลอดภัย, และผลกระทบคือดี(บังเอิญว่าหัวล้าน แต่รู้นะ อยากรู้)

ตัวอย่างที่ 1: ผลผลิตและความบริสุทธิ์ของการสกัด DNA จีโนม

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) ใช้ตัวอย่างดินจากแหล่งต่างๆ และปริมาณและความบริสุทธิ์ของ DNA จีโนมที่ได้รับจะแสดงในตารางต่อไปนี้:
ตัวอย่างที่ 2: ผลผลิตและความบริสุทธิ์ของการสกัด RNA ของเนื้อเยื่อ

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) ประมวลผลตัวอย่างเนื้อเยื่อต่างๆ และปริมาณและความบริสุทธิ์ของ RNA ที่ได้รับแสดงไว้ในตารางด้านล่าง (สำหรับเนื้อเยื่อของหนู):
อย่างไรก็ตาม อย่าคิดว่าคุณใช้ค่า OD เสร็จแล้วคุณมีการดูแลจุดสำคัญที่ฉันวาดให้คุณข้างหน้าหรือไม่?

สังเกต

โมเลกุลของกรดนิวคลีอิกที่แยกส่วนจะถูกคำนวณในการดูดกลืนแสงด้วยสมมติว่าคุณมีจีโนมดีเอ็นเอตกค้างใน RNA ค่า OD ของคุณจะสูงมาก แต่ไม่สามารถระบุความเข้มข้นที่แท้จริงของ RNA ได้RNA ของคุณเป็นหรือไม่ ไม่ชัดเจนว่ามีการย่อยสลายหรือไม่ ดังนั้นเรายังต้องการวิธีการประเมินที่ครอบคลุมเพื่อให้การตัดสินที่แม่นยำยิ่งขึ้น นั่นคือการประเมินความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกที่กล่าวถึงใน MIQE