ทุกคนกำลังพูดถึงหลักการของการทดลอง qRT-PCR, การออกแบบไพรเมอร์, การแปลผล ฯลฯ แต่ฉันคิดว่าฉันควรแบ่งปันกับคุณเกี่ยวกับการดำเนินการทดลองของ qRT-PCRเป็นเรื่องเล็กน้อย แต่เกี่ยวกับผลลัพธ์

ก่อนทำ qRT-PCR เราจำเป็นต้องมีความเข้าใจที่ชัดเจนเกี่ยวกับ RNA และวิธีการทำงานของเราท้ายที่สุด ความพยายามของเรามีเป้าหมายเพื่อให้ได้ผลลัพธ์มากกว่าการฝึกฝนเพียงอย่างเดียวดังนั้นก่อนที่จะทำ qRT-PCR เราจำเป็นต้องพิจารณาปัญหาต่อไปนี้ (บางประเด็นใช้ได้กับ SYBR เท่านั้น)

1 คุณแน่ใจหรือว่า RNA ของคุณไม่เสื่อมประสิทธิภาพ?

NanoDrop 2000 สามารถตรวจจับความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของ RNA เท่านั้น แต่ไม่สามารถตรวจจับความสมบูรณ์ของ RNA ได้

ค่า RNA (RNA Intesity Number) สามารถสะท้อนถึงความสมบูรณ์ของ RNA ซึ่งตรวจพบโดยระบบ Agilent 2100 Bioanalyzer

มะเดื่อ แผนผังของค่า RIN สำหรับตัวอย่าง RNA ต่างๆ (ยูคาริโอต)

อย่างไรก็ตาม ห้องปฏิบัติการโดยทั่วไปไม่มี Agilent 2100 Bioanalyzerในกรณีนี้ เราสามารถตรวจจับได้ผ่านฟอร์มาลดีไฮด์เจล แต่ความต้องการปริมาณ RNA ทั้งหมดนั้นสูง ดังนั้นวิธีที่เร็วที่สุดคือการใช้เจลอิเล็กโทรโฟเรซิสธรรมดาจำเป็นต้องอยู่ในสภาพแวดล้อมที่ปราศจากนิวคลีเอส ดังนั้นจึงจำเป็นต้องล้างถังอิเล็กโทรโฟเรซิส ขวดโซล ตัวยึดเจล และหวีด้วยน้ำ DEPCนอกจากนี้ agarose ยังปราศจาก nuclease (ตราบเท่าที่เพิ่งเปิดใหม่) และ Loading Buffer ควรเปิดใหม่มากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ โดยมีเจล 1.2%

โปรดทราบว่าเจลจะต้องละลายจนหมด มิฉะนั้น จะทำให้เกิดแถบที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน ดังตัวอย่างที่ 9 ในรูปหากแรงดันไฟฟ้าสูงเกินไปหรือทำงานนานเกินไปจะทำให้เกิดความร้อนและทำให้ RNA เสื่อมสภาพ ดังนั้นควรควบคุมแรงดันไฟฟ้าและเวลาอย่างสมเหตุสมผลนอกจากนี้ การวิ่งด้วยเจลยังสามารถระบุเพิ่มเติมได้ว่ามี DNA ตกค้างในตัวอย่างหรือไม่ และสังเกตว่ามีแถบตกค้างจำนวนมากในช่องจ่ายหรือไม่

รูป.การตรวจจับเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสของ RNA

2 คุณแน่ใจเกี่ยวกับความเข้มข้นของ cDNA ของคุณหรือไม่?

ประสบการณ์ของพี่ใหญ่ในห้องปฏิบัติการคือ cDNA ของระบบ 20 ul ที่ได้จากการผกผันแต่ละครั้งจะเจือจางโดยตรง 20 เท่า ในขณะที่น้องสาวหลังปริญญาเอกถูกเจือจาง 10 เท่าฉันมักจะขึ้นอยู่กับสถานการณ์เนื่องจากคุณภาพของ RNA ที่แต่ละคนกล่าวถึงนั้นแตกต่างกัน ระดับการกลับรายการจึงแตกต่างกัน และเทคโนโลยีการกลับรายการอาจไม่เสถียร

ดังนั้น ทุกครั้งที่ฉันได้รับ cDNA แบบย้อนกลับ ฉันจะเจือจางมันประมาณ 3 ครั้งก่อน จากนั้นใช้ยีนดูแลทำความสะอาดเพื่อทำ RT-PCR จำนวนรอบโดยทั่วไปคือ 25 รอบ เพื่อระบุความเข้มข้นเฉพาะ จากนั้นกำหนดปัจจัยการเจือจางขั้นสุดท้าย

3 คุณแน่ใจหรือว่าไพรเมอร์ของคุณใช้ง่าย?

สามารถผ่านเส้นโค้งการหลอมละลายของ qRT-PCR ได้ แต่ก็ยังมีค่าใช้จ่ายสำหรับห้องปฏิบัติการที่ไม่มีเงินจำนวนมาก เมื่อได้รับไพรเมอร์จำนวนมาก พวกเขาสามารถใช้ RT-PCR ธรรมดาเพื่อดูว่าเป็นแถบเดียวหรือไม่ และระบุความจำเพาะของไพรเมอร์หากห้องปฏิบัติการไม่มีเงินเพียงพอ สามารถระบุความจำเพาะของไพรเมอร์ทั้งหมดได้เพียงครั้งเดียวผ่านเส้นโค้งการหลอมละลาย

4 คุณแน่ใจหรือไม่ว่าเงื่อนไขการทดลองของคุณเหมาะสม

ควรป้องกัน SYBR จากแสงจ้า ดังนั้นให้พยายามปิดไฟเหนือศีรษะเมื่อเติมน้ำยา SYBR และต้องใช้แสงสลัวเท่านั้นจึงจะเสร็จสมบูรณ์

เก็บ SYBR ไว้ที่ 4°Cเมื่อใช้งาน ให้กลับด้านขึ้นและลงอย่างเบามือเพื่อผสมให้เข้ากันดีเพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดฟอง และห้ามหมุนวนอย่างแรง

น้องบางคนชอบขีดเส้นบนกระดาน PCR เพราะกลัวตัวอย่างปนกัน ซึ่งผิดเนื่องจากเครื่องหมายของคุณมีแนวโน้มที่จะส่งผลกระทบต่อการรวบรวมสัญญาณเรืองแสง โดยทั่วไปแล้วฉันแนะนำให้รุ่นน้องใช้สมุดบันทึกทดลองเพื่อช่วยในหน่วยความจำดังที่แสดงด้านล่าง

รูป.ไดอะแกรมการโหลดตัวอย่าง qRT-PCR

5 คุณแน่ใจหรือว่าคุณกำลังทำถูกต้อง?

อย่าลืมสวมถุงมือ สวมถุงมือ สวมถุงมือ และพูดสิ่งสำคัญสามครั้ง

เพื่อลดการเปิดรับแสงของ SYBR ลง ผมเองต้องการเพิ่มเทมเพลตก่อน ดังแสดงในรูปด้านล่างจากประสบการณ์ การเพิ่มเทมเพลตจำนวนเล็กน้อยอาจทำให้เกิดข้อผิดพลาดในการสุ่มตัวอย่างดังนั้น เพื่อลดข้อผิดพลาดที่เกิดจากการเพิ่มเทมเพลตจำนวนเล็กน้อย ฉันมักจะเพิ่มตัวอย่างอีกครั้งเป็นสองเท่า และเพิ่มปริมาณเป็นสองเท่าเมื่อเพิ่มตัวอย่างเพื่อลดปริมาณ H2O2 ที่เพิ่ม

รูป.แผนผังของการโหลด qRT-PCR

จากนั้นกำหนดค่าระบบ qRT-PCR ดังนี้

รูป.แผนภาพการเตรียมระบบ qRT-PCR

หมายเหตุ: กระบวนการกำหนดค่าต้องทำบนน้ำแข็ง

หลังจากเพิ่มตัวอย่างแล้ว ให้วางฟิล์มปิดผนึกแบบใสพยายามอย่าสัมผัสพื้นผิวของฟิล์มซีลใสด้วยมือของคุณ เพียงแค่ใช้งานจากช่องว่างทั้งสองด้านของฟิล์มเนื่องจากลายนิ้วมืออาจส่งผลต่อการรวบรวมสัญญาณเรืองแสงจากนั้นใช้เครื่องหมุนเหวี่ยงเพื่อหมุนเหวี่ยงอย่างรวดเร็วเป็นเวลา 10 วินาทีด้วยความเร็วต่ำเพื่อป้องกันไม่ให้ตัวอย่างแขวนบนผนัง

สินค้าที่เกี่ยวข้อง:

ชุด Cell Direct RT-qPCR

RT Easy II