COVID-19 เป็นโรคติดเชื้อที่เกิดจากกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง Coronavirus Type 2 เมื่อมีคนติดเชื้อ อาการที่พบบ่อยที่สุด ได้แก่ มีไข้ ไอ และหายใจถี่

ตัวอย่างที่ใช้สำหรับการทดสอบสามารถเก็บได้ด้วยไม้กวาดหลังโพรงหลังจมูกหรือไม้กวาดในช่องปาก

พีซีอาร์คืออะไร?

วิธีมาตรฐานในการตรวจหาไวรัสโคโรนาคือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส PCRนี่เป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในอณูชีววิทยามันสามารถคัดลอกชิ้นส่วน DNA ที่เฉพาะเจาะจงนับล้านถึงพันล้านได้อย่างรวดเร็ว

ไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ประกอบด้วยจีโนม RNA สายเดี่ยวที่ยาวมากในการตรวจจับไวรัสเหล่านี้ด้วย PCR นั้น โมเลกุล RNA จะต้องถูกแปลงเป็นลำดับดีเอ็นเอคู่สมของพวกมันโดยรีเวิร์สทรานสคริปเทส จากนั้นจึงขยาย DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ได้ด้วยกระบวนการ PCR มาตรฐาน ซึ่งรู้จักกันทั่วไปในชื่อ RT-PCR

กระบวนการ RT-PCR

การสกัด RNA

ในการดำเนินการตามวิธีนี้ โดยทั่วไป RNA ของไวรัสควรถูกแยกออกสามารถใช้ชุดการทำให้บริสุทธิ์ RNA ได้หลากหลายเพื่อการแยกสารที่สะดวก รวดเร็ว และมีประสิทธิภาพ

ในการแยก RNA ของไวรัสโดยใช้ชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์ ขั้นแรกให้เพิ่มตัวอย่างลงในหลอดไมโครเซนติฟิวจ์ แล้วผสมกับบัฟเฟอร์สลายบัฟเฟอร์นี้ถูกทำให้เสียสภาพธรรมชาติสูงและมักประกอบด้วยฟีนอลและกัวนิดีนไอโซไทโอไซยาเนตนอกจากนี้ สารยับยั้ง RNase มักจะอยู่ในบัฟเฟอร์ lysis เพื่อให้แน่ใจว่ามีการแยก RNA ของไวรัสที่ไม่เสียหาย

หลังจากเพิ่มบัฟเฟอร์การสลายแล้ว ให้วนท่อผสมด้วยพัลส์และบ่มที่อุณหภูมิห้องจากนั้นไวรัสจะถูกสลายภายใต้สภาวะที่ทำให้เสียสภาพสูงโดยบัฟเฟอร์การสลาย

หลังจากแยกตัวอย่างแล้ว หลอดหมุนเหวี่ยงจะใช้สำหรับขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ตัวอย่างถูกโหลดลงในหลอดปั่นแยก จากนั้นปั่นแยก

ขั้นตอนนี้เป็นวิธีการสกัดด้วยเฟสของแข็ง ซึ่งเฟสที่อยู่นิ่งประกอบด้วยเมทริกซ์ซิลิกาเจล

ภายใต้สภาวะเกลือและค่า pH ที่เหมาะสม โมเลกุล RNA จะจับกับเยื่อหุ้มซิลิกา

ในเวลาเดียวกัน โปรตีนและสารปนเปื้อนอื่นๆ จะถูกกำจัดออกไป

หลังจากการปั่นแยก ให้ใส่ท่อปั่นแยกลงในท่อรวบรวมที่สะอาด ทิ้งสิ่งกรอง จากนั้นเติมบัฟเฟอร์การซัก

วางท่อในเครื่องหมุนเหวี่ยงอีกครั้งเพื่อบังคับให้บัฟเฟอร์ล้างผ่านเมมเบรนสิ่งนี้จะขจัดสิ่งเจือปนที่เหลืออยู่ทั้งหมดออกจากเมมเบรน เหลือเพียง RNA ที่จับกับซิลิกาเจล

หลังจากล้างตัวอย่างแล้ว ให้ใส่หลอดลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ที่สะอาด และเพิ่มบัฟเฟอร์สำหรับชะ

จากนั้นจะปั่นแยกเพื่อบังคับให้สารละลายบัฟเฟอร์ผ่านเมมเบรนบัฟเฟอร์การชะล้างจะขจัด RNA ของไวรัสออกจาก spin column และรับ RNA ที่บริสุทธิ์ปราศจากโปรตีน สารยับยั้ง และสิ่งปนเปื้อนอื่นๆ

ขั้นตอนที่ 2

ผสมเข้มข้น

หลังจากแยก RNA ของไวรัสแล้ว ขั้นตอนต่อไปคือการเตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยาสำหรับการขยาย PCRในขั้นตอนนี้จะใช้สมาธิสารละลายเข้มข้นนี้เป็นสารละลายเข้มข้นผสมล่วงหน้าซึ่งประกอบด้วยพรีมิกซ์, รีเวิร์สทรานสคริปเทส, นิวคลีโอไทด์, ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์, รีเวิร์สไพรเมอร์, โพรบ TaqMan และ DNA โพลิเมอร์

ในที่สุด เพื่อให้ส่วนผสมของปฏิกิริยานี้สมบูรณ์ เทมเพลต RNA จะถูกเพิ่มเข้าไปหลอดถูกผสมโดยการวนแบบพัลส์ จากนั้นจึงโหลดส่วนผสมของปฏิกิริยาลงในแผ่น PCRเพลต PCR มักจะประกอบด้วย 96 หลุมและสามารถวิเคราะห์ตัวอย่างได้หลายตัวอย่างในเวลาเดียวกัน

ขั้นตอนที่ 3

การขยาย PCR

ถัดไป วางเพลตในเครื่อง PCR ซึ่งเป็นเครื่องหมุนเวียนความร้อน

RT-PCR แบบเรียลไทม์ใช้เพื่อตรวจหาไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ 2019 โดยขยายลำดับเป้าหมายในยีน RdrRP, ยีน E และยีน Nการเลือกยีนเป้าหมายขึ้นอยู่กับไพรเมอร์และลำดับโพรบ

ขั้นตอนแรกของ RT-PCR คือการถอดความแบบย้อนกลับสายแรกของ DNA ประกอบถูกสังเคราะห์ขึ้น ซึ่งเริ่มต้นโดย PCR reverse primer ซึ่งจับกับส่วนเสริมของ RNA genome ของไวรัสจากนั้นย้อนกลับทรานสคริปเทสจะเพิ่มนิวคลีโอไทด์ของ DNA ไปที่ 3′end ของไพรเมอร์เพื่อสังเคราะห์ DNA เสริมกับ RNA ของไวรัสอุณหภูมิและระยะเวลาของขั้นตอนนี้ขึ้นอยู่กับไพรเมอร์ RNA เป้าหมาย และรีเวิร์สทรานสคริปเทสที่ใช้

ถัดไป จะใช้ขั้นตอนการเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้น ซึ่งส่งผลให้เกิดการเสียสภาพธรรมชาติของ RNA-DNA ไฮบริดขั้นตอนนี้จำเป็นต่อการกระตุ้น DNA polymeraseในเวลาเดียวกัน รีเวิร์สทรานสคริปเทสจะถูกปิดใช้งาน

PCR ประกอบด้วยชุดวงจรความร้อนแต่ละรอบประกอบด้วยขั้นตอนการเสียสภาพธรรมชาติ การหลอม และการขยาย

ขั้นตอนการเสียสภาพธรรมชาติเกี่ยวข้องกับการให้ความร้อนแก่ห้องปฏิกิริยาถึง 95 องศาเซลเซียส และใช้มันในการเสียสภาพธรรมชาติของแม่แบบดีเอ็นเอเกลียวคู่

ในขั้นตอนต่อไป อุณหภูมิในการทำปฏิกิริยาจะลดลงเหลือ 58 องศาเซลเซียส ทำให้ไพรเมอร์ด้านหน้าหลอมเข้ากับส่วนเสริมของแม่แบบดีเอ็นเอสายเดี่ยวอุณหภูมิการหลอมขึ้นอยู่กับความยาวและองค์ประกอบของไพรเมอร์โดยตรง

ในขั้นตอนการขยาย DNA polymerase จะสังเคราะห์สาย DNA ใหม่ที่เสริมกับสายแม่แบบ DNAโดยการเพิ่มนิวเคลียสอิสระประกอบกับแม่แบบในทิศทาง 5′ถึง 3′จากส่วนผสมของปฏิกิริยาอุณหภูมิของขั้นตอนนี้ขึ้นอยู่กับ DNA polymerase ที่ใช้

หลังจากรอบแรก จะได้ DNA เป้าหมายที่มีเกลียวสองเส้น

จากนั้นเข้าสู่รอบที่สองDNA ที่มีเกลียวสองเส้นถูกทำให้เสียธรรมชาติเพื่อสร้างโมเลกุล DNA ที่มีเกลียวเดี่ยวสองโมเลกุล

ในขั้นตอนต่อไป อุณหภูมิของปฏิกิริยาจะลดลง ไพรเมอร์จะถูกอบอ่อนไปยังแม่แบบ DNA แบบเส้นเดี่ยวแต่ละอัน และโพรบ Taq-man จะถูกอบอ่อนไปยังส่วนเสริมของ DNA เป้าหมาย

โพรบ TaqMan ประกอบด้วยฟลูออโรฟอร์ที่เชื่อมโยงโควาเลนต์กับปลายที่ 5 ของโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์เมื่อตื่นเต้นกับแหล่งกำเนิดแสงของนักปั่น ฟลูออโรฟอร์จะปล่อยสารเรืองแสงออกมานอกจากนี้ โพรบยังประกอบด้วยตัวดับที่ปลายด้านที่ 3ความใกล้ชิดของยีนนักข่าวกับตัวดับป้องกันการตรวจจับการเรืองแสง

ในขั้นตอนการต่อ DNA พอลิเมอเรสจะสังเคราะห์สายใหม่เมื่อพอลิเมอเรสไปถึงโพรบ TaqMan กิจกรรม 5′nuclease ภายในของมันจะตัดโพรบ แยกสีย้อมออกจากสารดับ

ในแต่ละรอบของ PCR จะมีการปลดปล่อยโมเลกุลของสีย้อมมากขึ้น ส่งผลให้ความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์เพิ่มขึ้นตามสัดส่วนของจำนวนแอมพลิคอนที่สังเคราะห์ขึ้น

วิธีนี้ทำให้สามารถประมาณจำนวนของลำดับที่กำหนดซึ่งมีอยู่ในตัวอย่างได้จำนวนของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีเกลียวคู่เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบดังนั้นจึงสามารถใช้ PCR เพื่อวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีขนาดเล็กมากได้

สำหรับการวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนต์, หลอดฮาโลเจนทังสเตน, ตัวกรองการกระตุ้น, ตัวสะท้อนแสง, เลนส์, ตัวกรองการปล่อยก๊าซ และกล้อง CCD ที่ใช้อุปกรณ์ควบการชาร์จ

ขั้นตอนที่ 4 ตรวจจับ

สำหรับการวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนต์, หลอดฮาโลเจนทังสเตน, ตัวกรองการกระตุ้น, ตัวสะท้อนแสง, เลนส์, ตัวกรองการปล่อยก๊าซ และกล้อง CCD ที่ใช้อุปกรณ์ควบการชาร์จ

แสงที่ผ่านการกรองจากหลอดไฟจะสะท้อนโดยตัวสะท้อนแสง ผ่านเลนส์คอนเดนเซอร์ และโฟกัสไปที่กึ่งกลางของแต่ละรูจากนั้นแสงเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจากรูจะสะท้อนจากกระจก ผ่านตัวกรองแสง และถูกตรวจจับโดยกล้อง CCDในแต่ละรอบ PCR CCD สามารถตรวจจับแสงฟลูออโรฟอร์ที่กระตุ้นตัวเองได้

โดยจะแปลงแสงที่จับได้เป็นข้อมูลดิจิตอลวิธีนี้เรียกว่าเรียลไทม์พีซีอาร์ และช่วยให้สามารถตรวจสอบความคืบหน้าของปฏิกิริยาพีซีอาร์ได้แบบเรียลไทม์