ค่า Ct เป็นรูปแบบการนำเสนอผลลัพธ์ที่สำคัญที่สุดของ PCR เชิงปริมาณเรืองแสงใช้ในการคำนวณความแตกต่างของการแสดงออกของยีนหรือจำนวนสำเนาของยีนดังนั้นค่า Ct ของปริมาณฟลูออเรสเซนซ์ที่ถือว่าสมเหตุสมผลคืออะไร?จะมั่นใจได้อย่างไรว่าช่วงของค่า Ct มีประสิทธิภาพ?

ค่า Ct คืออะไร?
ในระหว่างกระบวนการขยาย qPCR จำนวนรอบการขยายที่สอดคล้องกัน (Cycle Threshold) เมื่อสัญญาณเรืองแสงของผลิตภัณฑ์ขยายถึงเกณฑ์การเรืองแสงที่ตั้งไว้C ย่อมาจาก Cycle และ T ย่อมาจาก Thresholdพูดง่ายๆ ก็คือ ค่า Ct คือจำนวนรอบที่สอดคล้องกับเมื่อการขยายเทมเพลตเริ่มต้นถึงจำนวนผลิตภัณฑ์ที่กำหนดใน qPCRสิ่งที่เรียกว่า "ผลิตภัณฑ์จำนวนหนึ่ง" จะอธิบายเพิ่มเติมในภายหลัง

ค่า Ct ใช้ทำอะไร?

1.ความสัมพันธ์ระหว่างการขยายแบบเอกซ์โปเนนเชียล จำนวนเทมเพลต และค่า Ct
ตามหลักการแล้ว ยีนใน qPCR จะถูกสะสมโดยการขยายแบบเอกซ์โปเนนเชียลหลังจากจำนวนรอบที่กำหนดความสัมพันธ์ระหว่างจำนวนรอบการขยายและจำนวนผลิตภัณฑ์คือ จำนวนผลิตภัณฑ์ที่ขยาย = จำนวนแม่แบบเริ่มต้น × (1+En) จำนวนรอบอย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยา qPCR ไม่ได้อยู่ในสถานการณ์ที่เหมาะสมเสมอไปเมื่อปริมาณผลิตภัณฑ์ที่ขยายถึง "จำนวนผลิตภัณฑ์ที่แน่นอน" จำนวนรอบในขณะนี้คือค่า Ct และอยู่ในช่วงการขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลความสัมพันธ์ระหว่างค่า Ct และจำนวนของแม่แบบเริ่มต้น: มีความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างค่า Ct ของแม่แบบและลอการิทึมของหมายเลขสำเนาเริ่มต้นของแม่แบบยิ่งความเข้มข้นของเทมเพลตเริ่มต้นสูง ค่า Ct ก็จะยิ่งน้อยลงยิ่งความเข้มข้นของแม่แบบเริ่มต้นต่ำ ค่า Ct ก็จะยิ่งมากขึ้นเท่านั้น

2.เส้นโค้งการขยาย เกณฑ์การเรืองแสง และจำนวนผลิตภัณฑ์ PCR ที่แน่นอน
ปริมาณของผลิตภัณฑ์ขยาย qPCR จะแสดงโดยตรงในรูปของสัญญาณเรืองแสง นั่นคือ เส้นโค้งการขยายในช่วงเริ่มต้นของ PCR การขยายสัญญาณอยู่ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม จำนวนรอบน้อย การสะสมของผลิตภัณฑ์มีน้อย และระดับของการเรืองแสงไม่สามารถแยกความแตกต่างจากพื้นหลังของการเรืองแสงได้อย่างชัดเจนหลังจากนั้นการเรืองแสงจะเพิ่มขึ้นและเข้าสู่ระยะเอกซ์โปเนนเชียลปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR สามารถตรวจจับได้ ณ จุดหนึ่งเมื่อปฏิกิริยา PCR อยู่ในช่วงเลขชี้กำลัง ซึ่งสามารถใช้เป็น "ผลิตภัณฑ์จำนวนหนึ่ง" และเนื้อหาเริ่มต้นของเทมเพลตสามารถอนุมานได้จากสิ่งนี้ดังนั้นความเข้มของสัญญาณการเรืองแสงที่สอดคล้องกับผลิตภัณฑ์จำนวนหนึ่งจึงเป็นเกณฑ์การเรืองแสง

ในช่วงท้ายของ PCR เส้นโค้งการขยายจะไม่แสดงการขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลอีกต่อไป และจะเข้าสู่ช่วงเชิงเส้นและช่วงราบสูง

3. ความสามารถในการทำซ้ำของค่า Ct
เมื่อรอบ PCR ถึงหมายเลขรอบของค่า Ct แสดงว่าเพิ่งเข้าสู่ช่วงขยายสัญญาณแบบเอกซ์โพเนนเชียลที่แท้จริงในขณะนี้ ข้อผิดพลาดเล็กน้อยยังไม่ได้รับการขยาย ดังนั้นความสามารถในการทำซ้ำของค่า Ct จึงยอดเยี่ยม กล่าวคือ เทมเพลตเดียวกันถูกขยายในเวลาที่ต่างกันหรือในหลอดที่แตกต่างกันในเวลาเดียวกันแอมพลิฟายเออร์ ค่า Ct ที่ได้จะคงที่

1. ประสิทธิภาพการขยาย En
ประสิทธิภาพการขยาย PCR หมายถึงประสิทธิภาพที่พอลิเมอเรสแปลงยีนที่จะขยายเป็นแอมพลิคอนประสิทธิภาพการขยายเมื่อโมเลกุล DNA หนึ่งโมเลกุลเปลี่ยนเป็นโมเลกุล DNA สองโมเลกุลคือ 100%ประสิทธิภาพการขยายมักแสดงเป็น Enเพื่ออำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์บทความต่อๆ ไป จะมีการแนะนำปัจจัยที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพการขยายเสียงโดยสังเขป

2.ช่วงของค่า Ct
ค่า Ct อยู่ระหว่าง 15-35หากค่า Ct น้อยกว่า 15 จะถือว่าการขยายอยู่ในช่วงของระยะเวลาพื้นฐานและยังไม่ถึงเกณฑ์การเรืองแสงตามหลักการแล้ว มีความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างค่า Ct และลอการิทึมของหมายเลขสำเนาเริ่มต้นของแม่แบบ ซึ่งก็คือเส้นโค้งมาตรฐานผ่านเส้นโค้งมาตรฐาน เมื่อประสิทธิภาพการขยายเป็น 100% ค่า Ct ที่คำนวณได้สำหรับการหาจำนวนสำเนาเดียวของยีนจะอยู่ที่ประมาณ 35 หากมีค่ามากกว่า 35 จำนวนสำเนาเริ่มต้นของแม่แบบจะน้อยกว่า 1 ตามทฤษฎี ซึ่งถือว่าไม่มีความหมาย

สำหรับช่วงของยีน Ct ที่แตกต่างกัน เนื่องจากความแตกต่างของจำนวนการคัดลอกยีนและประสิทธิภาพการขยายในจำนวนเทมเพลตเริ่มต้น จึงจำเป็นต้องสร้างเส้นโค้งมาตรฐานสำหรับยีนและคำนวณช่วงการตรวจจับเชิงเส้นของยีน

3.ปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อค่า Ct
จากความสัมพันธ์ระหว่างจำนวนรอบการขยายและจำนวนผลิตภัณฑ์: จำนวนผลิตภัณฑ์ที่ขยาย = จำนวนแม่แบบเริ่มต้น × (1+En) จำนวนรอบ จะเห็นได้ว่าภายใต้สภาวะที่เหมาะสม จำนวนแม่แบบเริ่มต้นและ En จะมีผลกระทบเชิงลบต่อค่า Ctความแตกต่างของคุณภาพเทมเพลตหรือประสิทธิภาพการขยายจะทำให้ค่า Ct มากหรือน้อยเกินไป

4.ค่า Ct มากหรือน้อยเกินไป