คุณสมบัติที่โดดเด่นของปฏิกิริยา PCR คือความสามารถในการขยายสัญญาณขนาดใหญ่และความไวสูงมากเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพ PCR และประสิทธิภาพการตรวจจับ เรามุ่งมั่นที่จะปรับปรุงความสามารถในการขยาย PCR และความไวในการตรวจจับ แต่ปัญหาที่น่าปวดหัวอยู่ในขั้นตอนของการทดลองมักจะเกิดผลบวกปลอม และการปนเปื้อนข้ามตัวอย่างหรือการปนเปื้อนผลิตภัณฑ์ PCR จำนวนเล็กน้อยอาจทำให้เกิดผลบวกลวงในการทดลอง
การปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ PCR ห้าประเภท
มีหลายสาเหตุสำหรับการปนเปื้อนของ PCR ซึ่งสามารถแบ่งออกเป็นประเภทต่างๆ ได้คร่าวๆ ดังนี้:
การปนเปื้อนของตัวอย่างมีสาเหตุหลักมาจากการปนเปื้อนของภาชนะเก็บตัวอย่าง หรือเมื่อวางชิ้นงานแล้ว เกิดการรั่วไหลออกจากภาชนะเนื่องจากการปิดผนึกหลวม หรือชิ้นงานติดอยู่ด้านนอกของภาชนะ ซึ่งทำให้เกิดการปนเปื้อนข้ามการปนเปื้อนนำไปสู่การปนเปื้อนระหว่างตัวอย่างตัวอย่างจุลินทรีย์บางชนิด โดยเฉพาะไวรัส สามารถแพร่กระจายด้วยละอองลอยหรือก่อตัวเป็นละออง ทำให้เกิดการปนเปื้อนร่วมกัน
สาเหตุหลักคือในระหว่างการเตรียมรีเอเจนต์ PCR ปืนตัวอย่าง ภาชนะบรรจุ น้ำกลั่นสองชั้น และสารละลายอื่นๆ ปนเปื้อนโดยแม่แบบกรดนิวคลีอิก PCR
ในห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยาและห้องปฏิบัติการบางแห่งที่ใช้พลาสมิดโคลนเป็นตัวควบคุมเชิงบวก ปัญหาการปนเปื้อนของพลาสมิดจากโคลนก็พบได้บ่อยเช่นกันเนื่องจากเนื้อหาของการโคลนนิ่งพลาสมิดในหน่วยปริมาตรค่อนข้างสูง และจำเป็นต้องใช้เครื่องมือและรีเอเจนต์มากขึ้นในกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ และพลาสมิดในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตมีโอกาสสูงที่จะถูกปนเปื้อนเนื่องจากการเจริญเติบโตที่แข็งแกร่งและความสามารถในการสืบพันธุ์ของเซลล์ที่มีชีวิต
การปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ขยายเป็นปัญหาการปนเปื้อนที่พบบ่อยที่สุดในปฏิกิริยา PCRเนื่องจากปริมาณการคัดลอกของผลิตภัณฑ์ PCR มีปริมาณมาก (โดยทั่วไปคือ 1,013 สำเนา/มล.) ซึ่งสูงกว่าขีดจำกัดของจำนวนสำเนาการตรวจจับ PCR มาก การปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ PCR จำนวนเล็กน้อยอาจทำให้เกิดผลบวกลวงได้
มลพิษจากละอองลอยเป็นรูปแบบที่เป็นไปได้มากที่สุดของการปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ PCR และยังเป็นสิ่งที่มองข้ามได้ง่ายที่สุดอีกด้วยเกิดจากแรงเสียดทานระหว่างพื้นผิวของเหลวกับอากาศโดยทั่วไป การปนเปื้อนของละอองลอยสามารถเกิดขึ้นได้เมื่อเปิดฝา เมื่อดูดตัวอย่าง หรือแม้แต่เมื่อเขย่าหลอดปฏิกิริยาอย่างแรงจากการคำนวณ อนุภาคละอองลอยสามารถบรรจุสำเนาได้ 48,000 ชุด ดังนั้นมลพิษที่เกิดจากอนุภาคดังกล่าวจึงเป็นปัญหาที่สมควรได้รับความสนใจเป็นพิเศษ
โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ห้องปฏิบัติการทดสอบมักจะใช้ไพรเมอร์คู่เดียวกันในการทดสอบยีนบางตัวเมื่อเวลาผ่านไป การปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ PCR จำนวนมากจะเกิดขึ้นในพื้นที่ห้องปฏิบัติการเมื่อเกิดการปนเปื้อนดังกล่าวแล้ว การกำจัดให้หมดไปในเวลาอันสั้นทำได้ยาก
สำหรับมลพิษสามประเภทแรก เราสามารถใช้วิธีที่มีประสิทธิภาพในการหลีกเลี่ยง แต่มลพิษที่เกิดจากผลิตภัณฑ์ PCR นั้นป้องกันได้ยาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการก่อสร้างห้องปฏิบัติการ PCR ที่ไม่ได้มาตรฐานในกระบวนการ PCR เมื่อปลายปิเปตดูดและเป่าของเหลว และเปิดฝาครอบท่อ PCR จะเกิดละอองขึ้นโมเลกุลของ DNA ที่นำพาโดยละอองลอย (ละอองหนึ่งอันสามารถนำพา DNA นับหมื่นได้) กำจัดได้ยากเพราะพวกมันลอยอยู่ในอากาศเมื่อมีการแนะนำการทดลอง PCR รอบถัดไป ผลบวกลวงจะเกิดขึ้นอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้
ดังที่แสดงในรูปด้านล่าง การควบคุมเชิงลบยังขยายขอบเขตความสนใจที่สอดคล้องกัน:
ส่วนแรกของปัญหามลพิษ PCR และการป้องกันนี้จะแนะนำที่นี่ฉบับหน้าจะนำเสนอส่วนที่สอง "การป้องกันการปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ PCR" โปรดติดตาม!
เวลาที่โพสต์: Jul-25-2017
