ไดเร็กพีซีอาร์เป็นปฏิกิริยาที่ใช้เนื้อเยื่อของสัตว์หรือพืชโดยตรงในการขยายโดยไม่ต้องสกัดกรดนิวคลีอิกในหลาย ๆ วิธี PCR โดยตรงจะทำงานเหมือนกับ PCR ทั่วไป

ความแตกต่างหลักคือบัฟเฟอร์แบบกำหนดเองที่ใช้ใน PCR โดยตรง ตัวอย่างสามารถอยู่ภายใต้ปฏิกิริยา PCR ได้โดยตรงโดยไม่ต้องสกัดกรดนิวคลีอิก แต่มีข้อกำหนดที่สอดคล้องกันสำหรับความทนทานของเอนไซม์และความเข้ากันได้ของบัฟเฟอร์ที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยา PCR โดยตรง

แม้ว่าจะมีสารยับยั้ง PCR มากหรือน้อยในตัวอย่างทั่วไป แต่ PCR โดยตรงยังสามารถขยายได้อย่างน่าเชื่อถือภายใต้การทำงานของเอนไซม์และบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา PCR แบบดั้งเดิมต้องใช้กรดนิวคลีอิกคุณภาพสูงเป็นแม่แบบ ซึ่งสามารถยับยั้งความคืบหน้าของปฏิกิริยา PCR ที่ราบรื่นได้หากแม่แบบมีโปรตีนและสิ่งเจือปนอื่นๆปัจจุบัน Direct PCR เป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่ได้รับความนิยมมากขึ้นในด้านการวินิจฉัยระดับโมเลกุล

01 เดิมใช้ Direct PCR สำหรับสัตว์และพืช

การประยุกต์ใช้ PCR โดยตรงในช่วงแรกคือในด้านของสัตว์และพืช เช่น เลือด เนื้อเยื่อ และขนของหนู แมว แมว ไก่ กระต่าย แกะ ปศุสัตว์ ฯลฯ ใบพืชและเมล็ดพืช ฯลฯ ใช้เพื่อศึกษาจีโนไทป์ การดัดแปลงพันธุกรรม การตรวจจับพลาสมิด การวิเคราะห์สิ่งที่น่าพิศวงของยีน การระบุแหล่งที่มาของ DNA การระบุสปีชีส์ การวิเคราะห์ SNP และสาขาอื่นๆ

ฟิลด์เหล่านี้มีลักษณะทั่วไปบางอย่าง กล่าวคือ ปริมาณยีนเป้าหมายค่อนข้างสูงและการสกัดกรดนิวคลีอิกก็ลำบาก ดังนั้น PCR โดยตรงจึงไม่เพียงช่วยประหยัดเวลาและมีผลกระทบต่อผลลัพธ์เพียงเล็กน้อยเท่านั้น แต่ยังประหยัดค่าใช้จ่ายอีกด้วย

PCR โดยตรงที่ใช้สำหรับการตรวจหาเชื้อโรคเป็นเรื่องของปีที่ผ่านมา ผู้ผลิตน้ำยา PCR บางรายได้ใช้ความพยายามอย่างมากในทิศทางนี้เมื่อสร้างนวัตกรรมโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการแพร่ระบาดของโควิด-19 ผลิตภัณฑ์ตรวจจับดังกล่าวจำนวนมากได้ปรากฏตัวในตลาด เช่น ชุดตรวจจับกรดนิวคลีอิก SARS-CoV-2 (วิธีมัลติเพล็กซ์ PCR Fluorescent Probe) ที่วิจัยและพัฒนาโดย Foregene ซึ่งใช้เทคโนโลยี RT PCR แบบเรียลไทม์ (rRT-PCR) สำหรับการตรวจจับกรดนิวคลีอิก SARS-CoV-2 เชิงคุณภาพในตัวอย่างไม้กวาดหลังโพรงจมูกหรือช่องปากของมนุษย์

Foregene เป็นหนึ่งในบริษัทที่ใช้เทคโนโลยี Direct PCR สำหรับการตรวจจับ ORF1ab, N, E และตัวแปร กรดนิวคลีอิกของสายเลือดในตัวอย่างจากโพรงหลังโพรงจมูกหรือคอหลอดปากของมนุษย์ เช่น สายเลือด SARS-CoV-2 B.1.1.7 (สหราชอาณาจักร), สายเลือด B.1.351 (ZA), สายเลือด B.1.617 (IND) และสายเลือด P.1 (BR)

02  รีเอเจนต์ที่จำเป็นสำหรับ PCR โดยตรง

ตัวอย่าง Lysate

Lysate ตัวอย่างสามารถกำหนดค่าได้ด้วยตัวเองหรือซื้อความแตกต่างในองค์ประกอบของไลซีนยี่ห้อต่างๆ จะทำให้ความสามารถในการไลซีนแตกต่างกัน จากนั้นเวลาไลซีนจะต่างกันเล็กน้อยตัวอย่างเช่น สำหรับการเตรียมตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตว์ โดยทั่วไปแนะนำให้ใช้เวลา 30 นาทีหรือข้ามคืน และสารละลายสำหรับไวรัสอยู่ในช่วง 3-10 นาที

PCR มาสเตอร์มิกซ์

ขอแนะนำให้ใช้ DNA polymerase แบบ hot-start เพื่อเพิ่มการขยายที่เฉพาะเจาะจงและเพิ่มความสามารถในการขยายแกนหลักของ PCR โดยตรงคือพอลิเมอเรสที่มีความทนทานสูง

กำจัดหรือยับยั้งส่วนประกอบในตัวอย่างที่ส่งผลต่อการขยาย DNA

หลังจากที่ตัวอย่างได้รับการประมวลผลด้วยไลเสตแล้ว โปรตีน ไขมัน และเศษเซลล์อื่นๆ จะถูกปลดปล่อยออกมา สารเหล่านี้จะยับยั้งปฏิกิริยา PCRดังนั้น PCR โดยตรงจำเป็นต้องเพิ่มการกำจัดหรือสารยับยั้งที่สอดคล้องกันเพื่อลดอิทธิพลของปัจจัยเหล่านี้

03  รวมความรู้ 5 ประการของ PCR โดยตรง

ประการแรก เทคโนโลยี Direct PCR เป็นเทคโนโลยี PCR โดยตรงสำหรับตัวอย่างทางชีวภาพต่างๆภายใต้เงื่อนไขทางเทคนิคนี้ ไม่จำเป็นต้องแยกและสกัดกรดนิวคลีอิก ใช้ตัวอย่างเนื้อเยื่อโดยตรงเป็นวัตถุ และเพิ่มไพรเมอร์ของยีนเป้าหมายเพื่อทำปฏิกิริยา PCR

ประการที่สอง เทคโนโลยี Direct PCR ไม่เพียงแต่เป็นเทคโนโลยีการขยายแม่แบบ DNA แบบดั้งเดิมเท่านั้น แต่ยังรวมถึง PCR การถอดความย้อนกลับของแม่แบบ RNA อีกด้วย

ประการที่สาม เทคโนโลยี Direct PCR ไม่เพียงแต่ทำปฏิกิริยา PCR เชิงคุณภาพตามปกติบนตัวอย่างเนื้อเยื่อเท่านั้น แต่ยังรวมถึงปฏิกิริยา qPCR แบบเรียลไทม์ ซึ่งต้องการให้ระบบปฏิกิริยามีความสามารถในการต่อต้านการรบกวนของสารเรืองแสงพื้นหลังที่แข็งแกร่ง และการเรืองแสงภายนอกจะดับความสามารถในการต่อต้าน

ประการที่สี่ ตัวอย่างที่กำหนดเป้าหมายโดยเทคโนโลยี Direct PCR ต้องการเพียงการปล่อยแม่แบบกรดนิวคลีอิก และไม่กำจัดโปรตีน โพลีแซคคาไรด์ ไอออนของเกลือ ฯลฯ ที่ขัดขวางปฏิกิริยา PCRซึ่งต้องการพอลิเมอเรสของกรดนิวคลีอิกและ PCR Mix ในระบบปฏิกิริยาเพื่อให้มีความต้านทานและความสามารถในการปรับตัวที่ดีเยี่ยม เพื่อให้มั่นใจถึงกิจกรรมของเอนไซม์และความแม่นยำในการจำลองแบบภายใต้สภาวะที่ซับซ้อน

ประการที่ห้า ตัวอย่างเนื้อเยื่อที่กำหนดเป้าหมายโดยเทคโนโลยี Direct PCR โดยไม่มีการบำบัดเสริมคุณค่าด้วยกรดนิวคลีอิก และจำนวนแม่แบบมีขนาดเล็กมาก ซึ่งต้องการให้ระบบปฏิกิริยามีความไวและประสิทธิภาพในการขยายสูงมาก