ผมเชื่อว่าทุกคนมักจะพบปัญหาดังกล่าวหรือลักษณะดังกล่าวเมื่อทำปฏิกิริยา PCR แต่ส่วนใหญ่สามารถจำแนกได้เป็น 2 ปัญหาหลักคือ

การขยายแม่แบบยีนน้อยเกินไป (การขยาย);
การขยายยีนที่ไม่ใช่เป้าหมายมากเกินไป
การใช้สารเติมแต่งเป็นหนึ่งในกลยุทธ์ทั่วไปในการแก้ปัญหาเหล่านี้โดยปกติแล้ว บทบาทของสารเติมแต่งมีสองด้าน:
โครงสร้างรองของยีน (โครงสร้างรอง);
ลดการลงรองพื้นที่ไม่เฉพาะเจาะจง
วันนี้ บรรณาธิการจะแนะนำสั้น ๆ เกี่ยวกับสารเติมแต่งทั่วไปในปฏิกิริยา PCR และหน้าที่ของมัน
สารเติมแต่งที่ลดโครงสร้างทุติยภูมิ
ซัลฟอกไซด์(สพม.)
ตัวอย่างยีนด้วยเนื้อหา GC สูงอย่างไรก็ตาม DMSO ยังลดกิจกรรมของ Taq polymerase ลงอย่างมากดังนั้น ทุกคนจึงต้องสร้างความสมดุลระหว่างการเข้าถึงเทมเพลตกับกิจกรรมของพอลิเมอเรสตัวแก้ไขแนะนำว่าคุณสามารถลองใช้ DSMO ที่มีความเข้มข้นต่างๆ ได้ เช่น จาก 2% ถึง 10% เพื่อหาความเข้มข้นที่เหมาะกับการทดสอบของคุณ
ผงซักฟอกที่ไม่ใช่ไอออนิก
ผงซักฟอกที่ไม่มีไอออน เช่น 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 หรือ NP-40 มักจะลดโครงสร้างทุติยภูมิของ DNAแม้ว่าจะสามารถเพิ่มการขยายของยีนแม่แบบได้ แต่ก็จะทำให้เกิดปัญหาในการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงดังนั้น สารเติมแต่งเหล่านี้จึงทำงานได้ดีสำหรับปฏิกิริยา PCR ที่ให้ผลตอบแทนต่ำโดยไม่มีเศษผง แต่ไม่ดีนักสำหรับปฏิกิริยา PRC ที่ค่อนข้างไม่บริสุทธิ์ข้อดีอีกประการของผงซักฟอกที่ไม่มีไอออนิกคือการลดการปนเปื้อน SDSโดยปกติแล้วในระหว่างกระบวนการสกัดดีเอ็นเอ SDS จะถูกนำไปที่ขั้นตอน PCR ซึ่งจะยับยั้งการทำงานของพอลิเมอเรสอย่างมากดังนั้นการเติม Tween-20 หรือ Tween-40 0.5% ลงในปฏิกิริยาสามารถทำให้ผลกระทบด้านลบของ SDS เป็นกลางได้
เบทาอีน_
เบทาอีนสามารถปรับปรุงการขยาย DNA โดยการลดการสร้างโครงสร้างทุติยภูมิ และโดยทั่วไปยังเป็น "ความลึกลับ" นอกเหนือจากชุด PCR เชิงพาณิชย์หากคุณต้องการใช้เบทาอีน คุณควรใส่เบทาอีนหรือเบทาอีนโมโนไฮเดรต (เบทาอีนหรือเบทาอีนโมโนไฮเดรต) แต่ไม่ใส่เบทาอีนไฮโดรคลอไรด์ (เบทาอีน HCl) ปรับความเข้มข้นสุดท้ายที่ 1-1.7Mเบทาอีนยังสามารถช่วยปรับปรุงความจำเพาะเนื่องจากกำจัดการพึ่งพาองค์ประกอบคู่เบสของการหลอมละลายของดีเอ็นเอ/การเสียสภาพของดีเอ็นเอ
สารเติมแต่งเพื่อลดการรองพื้นที่ไม่เฉพาะเจาะจง
ฟอร์มาไมด์
Formamide เป็นสารเติมแต่ง PCR อินทรีย์ที่ใช้กันทั่วไปมันสามารถรวมกับร่องหลักและร่องรองใน DNA ซึ่งจะช่วยลดความเสถียรของเกลียวคู่ของ DNA หลักและลดอุณหภูมิหลอมเหลวของ DNAความเข้มข้นของฟอร์มาไมด์ที่ใช้ในการทดลอง PCR มักจะอยู่ที่ 1%-5%
เตตระเมทิลแอมโมเนียมคลอไรด์( บสส.)
Tetramethylammonium chloride สามารถเพิ่มความจำเพาะของการผสมข้ามพันธุ์ (ความจำเพาะของการผสมข้ามพันธุ์) และเพิ่มอุณหภูมิหลอมเหลวของ DNAดังนั้น TMAC จึงสามารถกำจัด priming ที่ไม่เฉพาะเจาะจงและลดการจับผิดของ DNA และ RNAถ้าคุณใช้ไพรเมอร์เสื่อมในปฏิกิริยา PCR อย่าลืมเติม TMAC ซึ่งมักใช้ที่ความเข้มข้น 15-100mM
สารเติมแต่งทั่วไปอื่น ๆ
นอกจากสารเติมแต่งสองประเภทที่กล่าวถึงข้างต้นแล้ว ยังมีสารเติมแต่งทั่วไปอีกมากมายในปฏิกิริยา PCR แม้ว่าพวกมันจะมีหน้าที่ต่างกัน แต่ก็มีความสำคัญมากเช่นกัน
แมกนีเซียมไอออน
ไอออนแมกนีเซียมเป็นปัจจัยร่วม (ปัจจัยร่วม) ที่ขาดไม่ได้ของพอลิเมอเรส กล่าวคือ หากไม่มีแมกนีเซียมไอออน โพลิเมอเรสจะไม่ทำงานอย่างไรก็ตาม แมกนีเซียมไอออนที่มากเกินไปอาจส่งผลต่อประสิทธิภาพของโพลีเมอเรสได้เช่นกันความเข้มข้นของแมกนีเซียมไอออนในแต่ละปฏิกิริยา PCR จะแตกต่างกันไปสารคีเลต (เช่น EDTA หรือซิเตรต) ความเข้มข้นของ dNTPs และโปรตีนล้วนส่งผลต่อความเข้มข้นของแมกนีเซียมไอออนดังนั้น หากคุณมีปัญหากับการทดลอง PCR ของคุณ คุณสามารถลองเปลี่ยนความเข้มข้นของแมกนีเซียมไอออนต่างๆ ได้ เช่น จาก 1.0 เป็น 4.0 มิลลิโมลาร์ โดยเว้นช่วงระหว่าง 0.5–1 มิลลิโมลาร์
เป็นที่น่าสังเกตว่ารอบการละลายน้ำแข็งหลายครั้งสามารถนำไปสู่การแบ่งชั้นความเข้มข้นของสารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ดังนั้นคุณต้องละลายให้หมดก่อนใช้ทุกครั้ง และผสมให้เข้ากันก่อนใช้
เซรั่มอัลบูมินจากวัว(อัลบูมินจากวัว, BSA)
ในการทดลองทางเคมีระดับโมเลกุล เซรั่มอัลบูมินจากวัวเป็นสารเติมแต่งทั่วไป โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการจำกัดการย่อยของเอนไซม์และการทดลอง PCRในปฏิกิริยา PCR BSA มีประโยชน์ในการลดสารปนเปื้อน เช่น สารประกอบฟีนอลและยังกล่าวอีกว่าสามารถลดการเกาะตัวของสารตั้งต้นกับผนังหลอดทดลองในปฏิกิริยา PCR โดยปกติแล้ว ความเข้มข้นของ BSA ที่เติมเข้าไปจะสูงถึง 0.8 มก./มล.
 
สินค้าที่เกี่ยวข้อง:
พีซีอาร์ ฮีโร่(มีสีย้อม)
พีซีอาร์ ฮีโร่