การตรวจสอบประสิทธิภาพของไพรเมอร์และโพรบในช่วงแรกของรีเอเจนต์ PCR และการกำหนดสภาวะการเกิดปฏิกิริยาที่เหมาะสมที่สุดเป็นสิ่งที่จำเป็นต้องมีเพื่อให้แน่ใจว่าการทดลองอย่างเป็นทางการดำเนินไปอย่างราบรื่น
ดังนั้นเราต้องยืนยันไพรเมอร์โพรบในระยะเริ่มต้นอย่างไร?
ตัวบ่งชี้หลัก ได้แก่ ค่าพื้นฐาน เส้นโค้งการขยาย ค่า ct ประสิทธิภาพการขยาย การตรวจจับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ CV เป็นต้น
บรรทัดฐาน
เส้นฐานคือเส้นแนวนอนในเส้นโค้งการขยาย PCRในสองสามรอบแรกของปฏิกิริยาการขยายสัญญาณ PCR สัญญาณการเรืองแสงจะไม่เปลี่ยนแปลงมากนักและก่อตัวเป็นเส้นตรงเส้นตรงนี้เป็นเส้นฐาน
เมื่อทำการคัดกรองโพรบ PCR Primer ให้สังเกตว่าค่าพื้นฐานนั้นอยู่ในระดับเดียวกันหรือไม่ความบริสุทธิ์ของความเข้มข้นของไพรเมอร์โพรบจะส่งผลต่อเส้นฐาน เช่น ทำให้เส้นฐานสูงขึ้นหรือลดลงพื้นฐานยังเป็นตัวบ่งชี้ที่ใช้งานง่ายมาก
เส้นโค้งการขยาย
ตัวบ่งชี้ที่ใช้งานง่ายอีกอย่างคือรูปร่างของเส้นโค้งการขยายสัญญาณทางที่ดีควรมีเส้นโค้งรูปตัว S เพื่อหลีกเลี่ยงการขยายสัญญาณทุติยภูมิหรือเส้นโค้งการขยายสัญญาณที่ผิดปกติอื่นๆ
ค่า Ct
จำนวนรอบที่สอดคล้องกับจุดเปลี่ยนจากเส้นฐานไปจนถึงการเติบโตแบบทวีคูณคือค่า Ct
สำหรับตัวอย่างเดียวกัน หัววัดไพรเมอร์ที่แตกต่างกันจะส่งผลให้เกิดกราฟการขยายสัญญาณที่แตกต่างกัน และค่า Ct ที่สอดคล้องกันจะได้รับผลกระทบจากประสิทธิภาพการขยายและระดับสัญญาณรบกวนในทางทฤษฎี ยิ่งค่า Ct ของไพรเมอร์โพรบที่เราเลือกน้อยเท่าไหร่ก็ยิ่งดีเท่านั้น
ประสิทธิภาพการขยาย
หนึ่งในวิธีการที่เชื่อถือได้และเสถียรที่สุดสำหรับการประเมินประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ PCR คือเส้นโค้งมาตรฐาน ซึ่งนักวิจัยก็ยอมรับอย่างกว้างขวางเช่นกันวิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการสร้างชุดตัวอย่างเพื่อควบคุมจำนวนสัมพัทธ์ของแม่แบบเป้าหมายตัวอย่างเหล่านี้มักจะทำโดยการเจือจางแบบอนุกรมของสารละลายเข้มข้น ที่ใช้บ่อยที่สุดคือการเจือจาง 10 เท่าใช้ชุดตัวอย่างที่เจือจาง ใช้โปรแกรม qPCR มาตรฐานในการขยายเพื่อให้ได้ค่า Cq และสุดท้ายวาดเส้นโค้งมาตรฐานตามความเข้มข้นของแต่ละตัวอย่างและค่า Cq ที่สอดคล้องกันเพื่อให้ได้สมการเชิงเส้น Cq= -klgX0+b และประสิทธิภาพการขยาย E=10(-1 /k)-1เมื่อใช้ qPCR สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ ประสิทธิภาพการขยายจะต้องอยู่ในช่วง 90%-110% (3.6>k>3.1)
การตรวจจับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ
เมื่อความเข้มข้นของตัวอย่างต่ำ อัตราการตรวจจับของโพรบไพรเมอร์ที่แตกต่างกันจะแตกต่างกันเราเลือกตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ 20 ตัวอย่างเพื่อทำซ้ำ และระบบไพรเมอร์-โพรบที่มีอัตราการตรวจจับสูงสุดนั้นดีที่สุด
ค่าสัมประสิทธิ์การแปรผัน (CV)
สามารถตรวจจับตัวอย่างที่ซ้ำกันได้ 10 ตัวอย่างด้วยโพรบไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน ตามมาตรฐานสายของรีเอเจนต์สำหรับการตรวจจับการขยายกรดนิวคลีอิก
รีเอเจนต์เชิงปริมาณ:
ความแม่นยำ
ความแม่นยำภายในหนึ่งแบทช์ควรเป็นไปตาม: ค่าสัมประสิทธิ์ของการแปรผัน (CV,%) ของค่าลอการิทึมของความเข้มข้นทดสอบคือ ≤5%เมื่อความเข้มข้นของตัวอย่างต่ำ ค่าสัมประสิทธิ์ของการแปรผัน (CV,%) ของลอการิทึมของความเข้มข้นในการตรวจจับจะเท่ากับ ≤10%
รีเอเจนต์เชิงคุณภาพ:
ความแม่นยำ
ความถูกต้องภายในหนึ่งชุดควรเป็นไปตาม:
(1) ค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันของค่า Ct (CV,%) ≤5%
ตัวอย่างเดียวกันถูกทดสอบพร้อมกัน 10 ครั้ง และผลการทดสอบควรสอดคล้องกัน
เวลาโพสต์: 18-2021 กันยายน
