PCR เป็นเทคโนโลยีการขยายกรดนิวคลีอิกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายและใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากความไวและความจำเพาะอย่างไรก็ตาม PCR ต้องการการเปลี่ยนแปลงสภาพธรรมชาติด้วยความร้อนซ้ำๆ และไม่สามารถกำจัดข้อจำกัดของการพึ่งพาเครื่องมือและอุปกรณ์ ซึ่งจำกัดการใช้งานในการทดสอบภาคสนามทางคลินิก

ตั้งแต่ต้นทศวรรษ 1990 ห้องปฏิบัติการหลายแห่งได้เริ่มพัฒนาเทคโนโลยีการขยายอุณหภูมิคงที่ซึ่งไม่ต้องการการสูญเสียสภาพธรรมชาติเนื่องจากความร้อนตอนนี้พวกเขาได้พัฒนาเทคโนโลยีการขยายความร้อนด้วยอุณหภูมิความร้อนแบบใช้วงเป็นสื่อกลาง เทคโนโลยีการขยายความร้อนด้วยความร้อนด้วยความร้อนด้วยเส้นใยทดแทน เทคโนโลยีการขยายความร้อนด้วยความร้อนแบบวงกลมกลิ้ง และการพึ่งพาลำดับกรดนิวคลีอิกเทคโนโลยีการขยายความร้อนแบบไอโซเทอร์มอลและเทคโนโลยีอื่นๆ 

Lการขยาย isothermal ของ oop-mediated

หลักการขยายขึ้นอยู่กับข้อเท็จจริงที่ว่า DNA อยู่ในสภาวะสมดุลไดนามิกที่อุณหภูมิประมาณ 65°Cเมื่อไพรเมอร์ถูกจับคู่เบสและขยายไปยังส่วนเสริมของ DNA ที่มีเกลียวคู่ สายอื่นจะแยกตัวออกและกลายเป็นสายเดี่ยว

ที่อุณหภูมินี้ DNA ใช้ไพรเมอร์เฉพาะ 4 ตัวเพื่ออาศัยพอลิเมอเรสของ DNA ที่มีการแทนที่ด้วยเกลียวเพื่อทำให้การสังเคราะห์ DNA ที่ถูกแทนที่ด้วยเกลียวมีการไหลเวียนด้วยตนเองอย่างต่อเนื่อง

ขั้นแรกให้กำหนด 6 ขอบเขตเฉพาะ F3, F2, F1, B1, B2, B3 บนยีนเป้าหมาย จากนั้นออกแบบไพรเมอร์ 4 ตัวตามภูมิภาคเฉพาะ 6 นี้ (ดังแสดงในรูปด้านล่าง):

Forward inner primer (FIP) ประกอบด้วย F1c และ F2

สีรองพื้นด้านในแบบย้อนกลับ (BIP) ประกอบด้วย B1c และ B2 และ TTTT ใช้เป็นสเปเซอร์ตรงกลาง

ไพรเมอร์ชั้นนอก F3 และ B3 ประกอบด้วยบริเวณ F3 และ B3 ตามลำดับบนยีนเป้าหมาย

ในระบบปฏิกิริยา LAMP ความเข้มข้นของไพรเมอร์ภายในเป็นหลายเท่าของไพรเมอร์ภายนอกไพรเมอร์ชั้นในจะถูกรวมเข้ากับเส้นใยแม่แบบก่อนเพื่อสังเคราะห์เส้นใยเสริมเพื่อสร้างเส้นใยคู่ของ DNAต่อจากนั้น ไพรเมอร์ชั้นนอกจะถูกรวมเข้ากับเส้นใยแม่แบบเพื่อสร้างเส้นใยคู่ของดีเอ็นเอภายใต้การทำงานของ BstDNA polymerase เส้นใยเสริมที่สังเคราะห์โดยไพรเมอร์ชั้นในจะถูกปลดปล่อยออกมาหลังจากเกิดปฏิกิริยาต่อเนื่องกัน ในที่สุดสายเสริมก็กลายเป็นสายดีเอ็นเอเดี่ยวที่มีโครงสร้างเป็นดัมเบล

โครงสร้างดัมเบล DNA เส้นเดี่ยวนั้นถูกใช้เป็นแม่แบบเพื่อสร้างโครงสร้าง DNA แบบสเตมลูปแบบเปลี่ยนผ่านที่มีปลายเปิดอย่างต่อเนื่องไพรเมอร์ชั้นในและชั้นนอกนำทางโครงสร้าง DNA ของโครงสร้างสเตมลูปในช่วงเปลี่ยนผ่านเพื่อรับปฏิกิริยาการเคลื่อนตัวของเส้นใยและการขยายตัวอย่างต่อเนื่อง และในที่สุดก็สร้างโครงสร้างสเตมลูปหลายตัวที่มีความยาวต่างกันส่วนผสมของดีเอ็นเอ

ข้อดีและข้อเสียของการขยายไอโซเทอร์มอลแบบใช้วงรอบ

ข้อดีของโคมไฟ:

(1) ประสิทธิภาพในการขยายสูง ซึ่งสามารถขยายสำเนาของยีนเป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพ 1-10 ชุดภายใน 1 ชั่วโมง และประสิทธิภาพการขยายเป็น 10-100 เท่าของ PCR ทั่วไป

(2) เวลาตอบสนองสั้น ความจำเพาะสูง และไม่จำเป็นต้องใช้อุปกรณ์พิเศษ

ข้อบกพร่องของหลอดไฟ:

(1) ข้อกำหนดสำหรับไพรเมอร์สูงเป็นพิเศษ

(2) ไม่สามารถใช้ผลิตภัณฑ์ที่ขยายสำหรับการโคลนและการจัดลำดับ แต่สามารถใช้สำหรับการตัดสินเท่านั้น

(3) เนื่องจากมีความไวสูง จึงเกิดละอองได้ง่าย ทำให้เกิดผลบวกปลอมและส่งผลต่อผลการทดสอบ

Sการขยายการกระจัด trand

Strand displacement amplification (SDA) เป็นเทคนิคการขยาย DNA แบบไอโซเทอร์มอล ในหลอดทดลอง โดยอิงจากปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่เสนอครั้งแรกโดยนักวิชาการชาวอเมริกัน Walker ในปี 1992

ระบบพื้นฐานของ SDA ประกอบด้วยเอ็นโดนิวคลีเอสที่มีข้อจำกัด, ดีเอ็นเอโพลิเมอเรสที่มีกิจกรรมการเคลื่อนตัวของเส้นใย, ไพรเมอร์สองคู่, dNTP และระบบแคลเซียมและแมกนีเซียมไอออนและบัฟเฟอร์

หลักการของการขยายการกระจัดของเกลียวอยู่บนพื้นฐานของลำดับการรู้จำเอ็นโดนิวคลีเอสที่มีข้อจำกัดที่ถูกดัดแปลงทางเคมีที่ปลายทั้งสองของ DNA เป้าหมายเอนโดนิวคลีเอสเปิดช่องว่างในสายดีเอ็นเอที่จุดจดจำ และดีเอ็นเอโพลิเมอเรสจะขยายช่องว่าง 3′ End และแทนที่สายดีเอ็นเอถัดไป

DNA สายเดี่ยวที่ถูกแทนที่สามารถรวมกับไพรเมอร์และขยายเป็นสายคู่โดย DNA polymeraseกระบวนการนี้ทำซ้ำอย่างต่อเนื่อง เพื่อให้ลำดับเป้าหมายได้รับการขยายอย่างมีประสิทธิภาพ

ข้อดีและข้อเสียของเทคโนโลยีขยายสัญญาณดิสเพลสเมนต์

ข้อดีของ SDA:

ประสิทธิภาพการขยายสูง เวลาตอบสนองสั้น ความเฉพาะเจาะจงสูง และไม่จำเป็นต้องใช้อุปกรณ์พิเศษ

ข้อบกพร่องของ SDA:

ผลิตภัณฑ์ไม่สม่ำเสมอ และผลิตภัณฑ์แบบเส้นเดี่ยวและแบบเส้นคู่บางส่วนมักถูกผลิตในวงจร SDA และการหางจะเกิดขึ้นอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้เมื่อตรวจพบโดยอิเล็กโตรโฟรีซิส

Rการขยายวงกลม olling

Rolling Circle Amplification (RCA) เสนอโดยการวาดภาพเกี่ยวกับวิธีการคัดลอก DNA จากสิ่งมีชีวิตที่ทำให้เกิดโรคโดยการหมุนวงกลมมันหมายถึงการใช้ DNA แบบวงกลมเส้นเดี่ยวเป็นแม่แบบที่อุณหภูมิคงที่ และ DNA polymerase พิเศษ (เช่น Phi29) ) ภายใต้การกระทำของการสังเคราะห์ DNA แบบวงกลมเพื่อให้เกิดการขยายของยีนเป้าหมาย

RCA สามารถแบ่งออกเป็นการขยายเชิงเส้นและการขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลประสิทธิภาพของ RCA เชิงเส้นสามารถเข้าถึง 10⁵ครั้งและประสิทธิภาพของอาร์ซีเอ็กซ์โพเนนเชียลสามารถเข้าถึง 10⁹ครั้ง.

ความแตกต่างอย่างง่าย ดังที่แสดงในรูปด้านล่าง การขยายเชิงเส้น a ใช้ไพรเมอร์ 1 ตัวเท่านั้น การขยายเสียงแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล b มีไพรเมอร์ 2 ตัว

Linear RCA เรียกอีกอย่างว่าไพรเมอร์เดี่ยว RCAไพรเมอร์จับกับ DNA แบบวงกลมและถูกขยายโดยการกระทำของ DNA polymeraseผลิตภัณฑ์นี้เป็นเส้นเดี่ยวเชิงเส้นที่มีลำดับซ้ำๆ จำนวนมากเป็นพันเท่าของความยาวของลูปเดียว

เนื่องจากผลิตภัณฑ์ของ RCA เชิงเส้นจะเชื่อมต่อกับไพรเมอร์เริ่มต้นเสมอ การตรึงสัญญาณได้ง่ายจึงเป็นข้อได้เปรียบที่สำคัญ

Exponential RCA หรือที่เรียกว่า Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA) ใน exponential RCA ไพรเมอร์หนึ่งตัวขยายผลิตภัณฑ์ RCA ไพรเมอร์ตัวที่สองผสมกับผลิตภัณฑ์ RCA และขยาย และการเปลี่ยนทดแทนนั้นผูกพันกับผลิตภัณฑ์ RCA แล้ว ไพรเมอร์ดาวน์สตรีมจะขยายเกลียว และขยายซ้ำและแทนที่เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์ขยายเสียง RCA เดนไดรต์

ข้อดีและข้อเสียของการขยายกรดนิวคลีอิกแบบวงกลมกลิ้ง

ข้อดีของอาร์ซีเอ:

ความไวสูง ความจำเพาะดี และใช้งานง่าย

ข้อบกพร่องของ RCA:

ปัญหาเบื้องหลังระหว่างการตรวจจับสัญญาณในระหว่างปฏิกิริยา RCA โพรบแม่กุญแจที่ไม่ได้หมุนเวียนและแม่แบบ DNA หรือ RNA ของโพรบที่ไม่ได้ผูกไว้อาจสร้างสัญญาณพื้นหลังบางอย่าง 

Nการขยายตามลำดับของกรด ucleicacid

การขยายตามลำดับของกรดนิวคลีอิก (NASBA) เป็นเทคโนโลยีใหม่ที่พัฒนาขึ้นบนพื้นฐานของ PCRเป็นการขยายกรดนิวคลีอิกแบบไอโซเทอร์มอลแบบต่อเนื่องโดยใช้ไพรเมอร์คู่ที่มีลำดับโปรโมเตอร์ T7เทคโนโลยีนี้สามารถขยายเทมเพลต RNA ได้ประมาณ 109 เท่าในเวลาประมาณ 2 ชั่วโมง ซึ่งสูงกว่าวิธี PCR ทั่วไปถึง 1,000 เท่า และไม่ต้องใช้อุปกรณ์พิเศษ

เทคโนโลยีนี้ถูกนำมาใช้ในการวินิจฉัยโรคอย่างรวดเร็วในทันทีที่ปรากฏ และปัจจุบันหลายบริษัทใช้วิธีนี้ในชุดตรวจหา RNA

แม้ว่าการขยาย RNA สามารถใช้เทคโนโลยี PCR การถอดความแบบย้อนกลับได้เช่นกัน แต่ NASBA ก็มีข้อดีในตัวเอง: สามารถทำได้ภายใต้สภาวะอุณหภูมิที่ค่อนข้างคงที่ และมีความเสถียรและแม่นยำกว่าเทคโนโลยี PCR แบบดั้งเดิม

ปฏิกิริยาอยู่ที่ 41 องศาเซลเซียส และต้องใช้เอนไซม์ AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase และไพรเมอร์ 1 คู่จึงจะเสร็จสมบูรณ์

กระบวนการส่วนใหญ่ประกอบด้วย:

ไพรเมอร์ไปข้างหน้ามีลำดับที่สมบูรณ์ของโปรโมเตอร์ T7ในระหว่างการเกิดปฏิกิริยา ไพรเมอร์ไปข้างหน้าจับกับสาย RNA และถูกเร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ AMV เพื่อสร้างสายคู่ DNA-RNA

RNase H ย่อย RNA ในสายคู่แบบไฮบริดและเก็บ DNA สายเดี่ยวไว้

ภายใต้การทำงานของรีเวิร์สไพรเมอร์และเอนไซม์ AMV จะเกิดสายดีเอ็นเอคู่ที่มีลำดับโปรโมเตอร์ T7

ภายใต้การทำงานของ T7 RNA polymerase กระบวนการถอดความจะเสร็จสมบูรณ์และมีการสร้าง RNA เป้าหมายจำนวนมาก

ข้อดีของ NASBA:

(1) ไพรเมอร์ของมันมีลำดับโปรโมเตอร์ T7 แต่ DNA สายคู่แปลกปลอมไม่มีลำดับโปรโมเตอร์ T7 และไม่สามารถขยายได้ ดังนั้นเทคโนโลยีนี้จึงมีความจำเพาะและความไวสูง

(2) NASBA รวมกระบวนการถอดความแบบย้อนกลับเข้ากับปฏิกิริยาการขยายโดยตรง ทำให้เวลาตอบสนองสั้นลง

ข้อเสียของ NASBA:

(1) ส่วนประกอบของปฏิกิริยามีความซับซ้อนมากขึ้น

(2) ต้องใช้เอนไซม์สามชนิดเพื่อทำให้ต้นทุนของปฏิกิริยาสูงขึ้น