สิ่งประดิษฐ์ที่ปฏิวัติวงการหลายอย่างในประวัติศาสตร์ของเทคโนโลยีการตรวจจับในความคิดของฉันคือเทคโนโลยีการสร้างภูมิคุ้มกันโดยอาศัยหลักการจับที่จำเพาะต่อแอนติเจน-แอนติบอดี เทคโนโลยี PCR และเทคโนโลยีการจัดลำดับวันนี้เราจะพูดถึงเทคโนโลยี PCRตามวิวัฒนาการของเทคโนโลยี PCR ผู้คนมักจะแบ่งเทคโนโลยี PCR ออกเป็นสามรุ่น: เทคโนโลยี PCR ธรรมดา เทคโนโลยี PCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์ และเทคโนโลยี PCR ดิจิทัล
Cเทคนิคออมมอนพีซีอาร์
คาร์รี มุลลิส (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis คิดค้นปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส (polymerase chain reaction, PCR) ในปี 1983 ว่ากันว่าเมื่อเขาขับรถให้แฟนสาว จู่ๆ เขาก็มีแรงบันดาลใจขึ้นมาและนึกถึงหลักการของ PCR (เกี่ยวกับประโยชน์ของการขับรถ)Kary Mullis ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีในปี 1993 The New York Times ให้ความเห็นว่า: "มีความแปลกใหม่และมีความหมายสูง เกือบจะแบ่งชีววิทยาออกเป็นยุคก่อน PCR และหลัง PCR
หลักการของ PCR: ภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของ DNA polymerase จะใช้ DNA สายแม่เป็นแม่แบบ และใช้ไพรเมอร์เฉพาะเป็นจุดเริ่มต้นของการขยาย และ DNA สายลูกที่เสริมกับ DNA แม่แบบสายแม่จะถูกคัดลอก ในหลอดทดลอง ผ่านการสูญเสียสภาพธรรมชาติ การหลอม การขยาย และขั้นตอนอื่นๆเป็นเทคโนโลยีการขยายการสังเคราะห์ DNA ในหลอดทดลอง ซึ่งสามารถขยาย DNA เป้าหมายใด ๆ ในหลอดทดลองได้อย่างรวดเร็วและเฉพาะเจาะจง
ข้อดีของ PCR ธรรมดา
1.วิธีการแบบคลาสสิก สมบูรณ์ตามมาตรฐานสากลและในประเทศ
2.ต้นทุนของรีเอเจนต์เครื่องมือลดลง
3.สามารถกู้คืนผลิตภัณฑ์ PCR สำหรับการทดลองอณูชีววิทยาอื่นๆ ได้
เครื่อง Foregene PCR ที่แนะนำ: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
สินค้าที่เกี่ยวข้อง: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
ข้อเสียของ PCR ธรรมดา
1.ง่ายต่อการเกิดมลพิษ
2.การดำเนินการที่ยุ่งยาก
3.การวิเคราะห์เชิงคุณภาพเท่านั้น
4.ความไวปานกลาง
5.มีการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจง และเมื่อแบนด์ที่ไม่เจาะจงมีขนาดเท่ากับแบนด์เป้าหมาย จะไม่สามารถแยกความแตกต่างได้
CPCR ที่ใช้อิเล็กโทรโฟรีซิส
เพื่อตอบสนองต่อข้อบกพร่องของ PCR ทั่วไป ผู้ผลิตบางรายได้แนะนำเครื่องมือที่ใช้หลักการของคาพิลลารีอิเล็กโตรโฟรีซิสขั้นตอนอิเล็กโตรโฟรีซิสหลังจากการขยาย PCR เสร็จสิ้นในเส้นเลือดฝอยความไวจะสูงขึ้นและสามารถแยกแยะความแตกต่างของฐานต่างๆ ได้ และ MAERKER สามารถคำนวณการขยายสัญญาณได้เนื้อหาของผลิตภัณฑ์ข้อเสียคือผลิตภัณฑ์ PCR ยังคงต้องเปิดและใส่เข้าไปในเครื่องมือ และยังมีความเสี่ยงสูงต่อการปนเปื้อน
CฝอยEอิเลคโตรโฟรีซิส
2. เทคโนโลยี PCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์ (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescent quantitative PCR หรือที่เรียกว่า Real-Time PCR เป็นเทคโนโลยีเชิงปริมาณกรดนิวคลีอิกใหม่ที่พัฒนาโดย PE (Perkin Elmer) ในปี 1995 ประวัติการพัฒนา PCR เชิงปริมาณเรืองแสงเป็นประวัติศาสตร์ของการต่อสู้ที่ตื่นเต้นเร้าใจของยักษ์ใหญ่ เช่น ABI, Roche และ Bio-Radหากคุณสนใจคุณสามารถตรวจสอบได้ปัจจุบันเทคนิคนี้เป็นเทคนิค PCR แบบกึ่งปริมาณที่เป็นผู้ใหญ่ที่สุดและใช้กันอย่างแพร่หลาย
เครื่อง qPCR ที่แนะนำ:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
วิธีย้อมเรืองแสง (SYBR Green I):SYBR Green I เป็นสีย้อมจับ DNA ที่ใช้บ่อยที่สุดสำหรับ PCR เชิงปริมาณ ซึ่งจับแบบไม่เจาะจงกับ DNA สายคู่ในสถานะอิสระ SYBR Green จะปล่อยสารเรืองแสงอ่อนๆ แต่เมื่อจับกับ DNA ที่มีเกลียวคู่แล้ว การเรืองแสงของมันจะเพิ่มขึ้น 1,000 เท่าดังนั้น สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ทั้งหมดที่ปล่อยออกมาจากปฏิกิริยาจะเป็นสัดส่วนกับปริมาณของ DNA แบบเกลียวคู่ที่มีอยู่ และจะเพิ่มขึ้นตามการเพิ่มขึ้นของผลิตภัณฑ์ที่ขยายเนื่องจากสีย้อมไม่จับกับ DNA ที่มีเกลียวสองเส้นโดยเฉพาะ จึงอาจสร้างผลบวกลวงได้
สินค้าที่เกี่ยวข้อง: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
วิธีการวัดหลอดฟลูออเรสเซนต์ (เทคโนโลยี Taqman): ระหว่างการขยายสัญญาณ PCR, โพรบเรืองแสงเฉพาะถูกเพิ่มเข้ามาพร้อมกันกับไพรเมอร์คู่หนึ่งหัววัดเป็นโอลิโกนิวคลีโอไทด์เชิงเส้น โดยมีกลุ่มนักข่าวเรืองแสงและกลุ่มดับเรืองแสงตามลำดับที่ปลายทั้งสองด้านเมื่อโพรบไม่เสียหาย สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่ปล่อยออกมาจากกลุ่มผู้รายงานจะถูกดูดกลืนโดยกลุ่มดับ และการตรวจจับไม่มีสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ในระหว่างการขยาย PCR (ในระยะขยาย) กิจกรรม Dicer ขนาด 5'-3' ของเอนไซม์ Taq จะย่อยและย่อยสลายโพรบ เพื่อให้แยกกลุ่มเรืองแสงนักข่าวและกลุ่มเรืองแสงดับ เพื่อให้ระบบตรวจสอบการเรืองแสงสามารถรับสัญญาณเรืองแสงได้ นั่นคือทุกครั้งที่ขยายสายโซ่ DNA โมเลกุลเรืองแสงจะก่อตัวขึ้น ซึ่งตระหนักถึงการซิงโครไนซ์ที่สมบูรณ์ของการสะสมของสัญญาณเรืองแสงและการก่อตัวของผลิตภัณฑ์ PCRวิธีการตรวจสอบ Taqman เป็นวิธีการตรวจจับที่ใช้บ่อยที่สุดในการตรวจทางคลินิก
สินค้าที่เกี่ยวข้อง: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
ข้อดีของ qPCR
1.วิธีการนี้สมบูรณ์แล้วและอุปกรณ์สนับสนุนและรีเอเจนต์เสร็จสมบูรณ์
2.ต้นทุนปานกลางของน้ำยา
3.ง่ายต่อการใช้
4.ความไวและความจำเพาะในการตรวจจับสูง
ข้อเสียของ qPCR
การกลายพันธุ์ของยีนเป้าหมายนำไปสู่การตรวจหาที่พลาดไป
ไม่สามารถระบุผลการตรวจจับของแม่แบบที่มีความเข้มข้นต่ำได้
มีข้อผิดพลาดมากเมื่อใช้เส้นโค้งมาตรฐานสำหรับการตรวจจับเชิงปริมาณ
3. เทคโนโลยีดิจิตอลพีซีอาร์ (digital PCR, dPCR)
Digital PCR เป็นเทคนิคสำหรับการหาปริมาณโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกแบบสัมบูรณ์เมื่อเปรียบเทียบกับ qPCR แล้ว Digital PCR สามารถอ่านจำนวนโมเลกุล DNA/RNA ได้โดยตรง ซึ่งเป็นปริมาณที่แน่นอนของโมเลกุลกรดนิวคลีอิกในตัวอย่างเริ่มต้นในปี 1999 Bert Vogelstein และ Kenneth W. Kin-zler ได้เสนอแนวคิดของ dPCR อย่างเป็นทางการ
ในปี 2549 Fluidigm เป็นบริษัทแรกที่ผลิตเครื่องมือ dPCR ที่ใช้ชิปในเชิงพาณิชย์ในปี 2552 Life Technologies ได้เปิดตัวระบบ OpenArray และ QuantStudio 12K Flex dPCRในปี 2556 Life Technologies ได้เปิดตัวระบบ QuantStudio 3DdPCR ซึ่งใช้เทคโนโลยีชิปไมโครฟลูอิดิกระดับนาโนความหนาแน่นสูงเพื่อกระจายตัวอย่างไปยังเซลล์แต่ละเซลล์ 20,000 เซลล์อย่างสม่ำเสมอในปฏิกิริยาได้ดี
ในปี 2554 Bio-Rad ได้เปิดตัวเครื่องมือ QX100 dPCR แบบหยด ซึ่งใช้เทคโนโลยีน้ำในน้ำมันเพื่อกระจายตัวอย่างอย่างสม่ำเสมอไปยังน้ำในน้ำมัน 20,000 หยด และใช้เครื่องวิเคราะห์หยดเพื่อวิเคราะห์หยดในปี 2555 RainDance ได้เปิดตัวเครื่องมือ RainDrop dPCR ซึ่งขับเคลื่อนด้วยก๊าซแรงดันสูง เพื่อแบ่งระบบปฏิกิริยามาตรฐานแต่ละระบบออกเป็นอิมัลชันปฏิกิริยาที่มีหยดขนาดเล็กระดับ 1 ล้านถึง 10 ล้านพิโคลิตร
จนถึงปัจจุบัน PCR ดิจิทัลได้แบ่งกลุ่มหลักออกเป็น 2 ฝ่าย ได้แก่ ประเภทชิปและประเภทหยดไม่ว่า PCR ดิจิทัลประเภทใด หลักการสำคัญคือการจำกัดการเจือจาง PCR ปลายทาง และการกระจายแบบปัวซองระบบปฏิกิริยา PCR มาตรฐานที่มีแม่แบบกรดนิวคลีอิกถูกแบ่งเท่าๆ กันออกเป็นปฏิกิริยา PCR นับหมื่น ซึ่งกระจายไปยังชิปหรือไมโครดรอปเล็ต เพื่อให้แต่ละปฏิกิริยามีโมเลกุลแม่แบบมากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ และปฏิกิริยา PCR แม่แบบโมเลกุลเดี่ยวจะดำเนินการโดยการอ่านการเรืองแสง การมีอยู่หรือไม่มีสัญญาณจะถูกนับ และการวัดปริมาณสัมบูรณ์จะดำเนินการหลังจากการสอบเทียบการกระจายปัวซองทางสถิติ
ต่อไปนี้เป็นคุณลักษณะของแพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลต่างๆ ที่ฉันเคยใช้:
1. Bio-Rad QX200 droplet digital PCR ไบโอ-ราดQX200 เป็นแพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลแบบคลาสสิก กระบวนการตรวจจับพื้นฐาน: 20,000 ตัวอย่างถูกสร้างขึ้นโดยเครื่องกำเนิดหยดน้ำ ไมโครดรอปเล็ตแบบน้ำในน้ำมันจะถูกขยายบนเครื่อง PCR ทั่วไป และสุดท้าย สัญญาณเรืองแสงของไมโครดรอปเล็ตแต่ละตัวจะถูกอ่านโดยเครื่องอ่านไมโครดรอปเล็ตการดำเนินการมีความซับซ้อนมากขึ้น และความเสี่ยงของมลพิษอยู่ในระดับปานกลาง
Xinyi TD1 micro-droplet digital PCRXinyi TD1 เป็นแพลตฟอร์ม PCR แบบดิจิทัลภายในประเทศ ซึ่งเป็นกระบวนการตรวจจับพื้นฐาน: สร้างหยดน้ำในน้ำมัน 30,000-50,000 หยดผ่านเครื่องสร้างหยด ขยายเสียงด้วยเครื่องมือ PCR ทั่วไป และสุดท้ายผ่านเครื่องอ่านหยดจะอ่านสัญญาณเรืองแสงของแต่ละหยดทั้งการสร้างหยดและการอ่านค่าในแพลตฟอร์มนี้ดำเนินการในชิปเฉพาะที่มีความเสี่ยงต่ำต่อการปนเปื้อน
STILLA Naica ไมโครหยดชิปดิจิตอล PCRSTILLA Naica เป็นแพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลที่ค่อนข้างใหม่กระบวนการตรวจจับพื้นฐานคือ: เติมสารละลายปฏิกิริยาลงในชิป ใส่ชิปลงในระบบสร้างและขยายไมโครดรอปเล็ต และสร้างไมโครดรอปเล็ต 30,000 ไมโครหยดการแพร่กระจายบนชิป และการขยาย PCR เสร็จสิ้นบนชิปจากนั้นชิปที่ขยายแล้วจะถูกถ่ายโอนไปยังระบบวิเคราะห์การอ่านแบบหยดขนาดเล็ก และสัญญาณเรืองแสงจะถูกอ่านโดยการถ่ายภาพเนื่องจากกระบวนการทั้งหมดเกิดขึ้นในชิปแบบปิด ความเสี่ยงของการปนเปื้อนจึงต่ำ
4. ชิปดิจิตอล PCR ชิป ThermoFisher QuantStudio 3D
ThermoFisher QuantStudio 3D เป็นอีกหนึ่งแพลตฟอร์มดิจิทัล PCR ที่ใช้ชิปแบบคลาสสิกกระบวนการตรวจจับพื้นฐานของมันคือ: เติมสารละลายปฏิกิริยาลงในตัวกระจาย และกระจายสารละลายปฏิกิริยาให้ทั่วถึงบนชิปด้วย 20,000 ไมโครเวลผ่านตัวกระจาย, ใส่ชิปบนเครื่อง PCR เพื่อขยาย และสุดท้ายใส่ชิปลงในเครื่องอ่านและถ่ายภาพเพื่ออ่านสัญญาณเรืองแสงการดำเนินการค่อนข้างซับซ้อน และกระบวนการทั้งหมดดำเนินการในชิปปิด และความเสี่ยงของการปนเปื้อนต่ำ
5. JN MEDSYS Clarity ชิปดิจิตอล PCR
JN MEDSYS Clarity เป็นแพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลประเภทชิปที่ค่อนข้างใหม่กระบวนการตรวจจับขั้นพื้นฐานคือ: เติมสารละลายปฏิกิริยาลงในอุปกรณ์ทา และกระจายสารละลายปฏิกิริยาให้ทั่วถึงบนหลอด PCR 10,000 หลอดที่ติดอยู่ในหลอด PCR ผ่านอุปกรณ์ทาบนชิปที่มีรูพรุนขนาดเล็ก สารละลายปฏิกิริยาจะเข้าสู่ชิปผ่านการกระทำของเส้นเลือดฝอย และท่อ PCR ที่มีชิปจะถูกวางไว้บนเครื่อง PCR เพื่อขยายสัญญาณ และสุดท้ายก็ใส่ชิปลงในเครื่องอ่านเพื่ออ่านสัญญาณเรืองแสงโดยการถ่ายภาพการดำเนินการมีความซับซ้อนมากขึ้นความเสี่ยงของการปนเปื้อนต่ำ
พารามิเตอร์ของแต่ละแพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลสรุปได้ดังนี้:
ตัวบ่งชี้การประเมินของแพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลคือ: จำนวนหน่วยแยก จำนวนช่องเรืองแสง ความซับซ้อนของการดำเนินการ และความเสี่ยงของการปนเปื้อนแต่สิ่งที่สำคัญที่สุดคือความแม่นยำในการตรวจจับวิธีหนึ่งในการประเมินแพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลคือการใช้แพลตฟอร์ม PCR ดิจิทัลหลายตัวเพื่อตรวจสอบซึ่งกันและกัน และอีกวิธีหนึ่งคือการใช้สารมาตรฐานที่มีค่าที่ถูกต้อง
ข้อดีของ dPCR
1.บรรลุปริมาณที่แน่นอน
2.ความไวและความจำเพาะที่สูงขึ้น
3.สามารถตรวจจับตัวอย่างสำเนาต่ำ
ข้อเสียของ dPCR1. อุปกรณ์และรีเอเจนต์ราคาแพง 2. การทำงานที่ซับซ้อนและใช้เวลาตรวจจับนาน 3. ระยะการตรวจจับแคบ
ในปัจจุบัน เทคโนโลยี PCR ทั้ง 3 รุ่นมีข้อดีและข้อเสียของตัวเอง และแต่ละรุ่นมีฟิลด์แอ็พพลิเคชันของตัวเอง และไม่ใช่ความสัมพันธ์ที่คนรุ่นหนึ่งมาแทนที่อีกรุ่นหนึ่งความก้าวหน้าอย่างต่อเนื่องของเทคโนโลยีได้เพิ่มพลังใหม่ให้กับเทคโนโลยี PCR ทำให้สามารถปลดล็อกทิศทางการใช้งานหนึ่งแล้วอีกทิศทาง ทำให้การตรวจจับกรดนิวคลีอิกสะดวกและแม่นยำยิ่งขึ้น
ที่มา: ดร.หยวนพาไปตรวจ
สินค้าแนะนำ:
เวลาโพสต์: 18 พ.ย.-2565
